遠(yuǎn)紅外輻照對大米黃曲霉孢子及其產(chǎn)毒能力的影響

蔣 婧張玉明全俊成范柳萍

(1. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2. 上海熱麗科技集團(tuán)有限公司，上海 200125)

稻谷作為中國最重要的糧食作物之一，極易被微生物和真菌毒素污染，其中黃曲霉和黃曲霉毒素污染最為嚴(yán)重。真菌毒素中AFB1毒性最大，被聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織認(rèn)定為Ⅰ類致癌物質(zhì)。目前糧食的殺菌方法有紫外輻照[1-2]、脈沖強(qiáng)光[3]、遠(yuǎn)紅外[4]等物理法；化學(xué)法中二氧化氯[5]及臭氧[6]主要應(yīng)用在糙米的殺菌中；生物防治包括抑制菌株生長[7-8]、抑制菌株產(chǎn)毒和降解黃曲霉毒素等[9]。紅外輻照依靠其熱效應(yīng)及特征吸收導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)變性和酶失活，微生物代謝受到嚴(yán)重的干擾從而影響增殖[10]，此外紅外加熱具有加熱效率高、無殘留、加熱慣性小易控制、設(shè)備投資小等優(yōu)點[11]，在食品安全與加工等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。

目前，遠(yuǎn)紅外輻照技術(shù)在食品領(lǐng)域的應(yīng)用主要側(cè)重于以加熱脫水為目的的烘焙、干燥等方面，在殺菌方面的報道較少。Tubasa等[12]研究了遠(yuǎn)紅外輻照與熱傳導(dǎo)聯(lián)合作用對柑橘白色念珠菌和黑曲霉孢子的殺菌效果；Hamanaka[13]、Athanassiou[14]、Erdogdu[15]等研究了遠(yuǎn)紅外對霉菌的致死作用；Wang等[16]采用遠(yuǎn)紅外結(jié)合60 ℃保溫120 min處理對黃曲霉菌具有良好的殺菌效果，但其保溫時間長，且研究對象為黃曲霉菌，未涉及對黃曲霉孢子和產(chǎn)毒能力的影響。

本試驗以接種黃曲霉孢子的大米為原料，采用遠(yuǎn)紅外輻照殺菌技術(shù)，研究紅外輻照對黃曲霉的殺菌效果、生長曲線和產(chǎn)AFB1能力的影響，并考察紅外輻照對大米色澤、游離氨基酸、可溶性蛋白等理化指標(biāo)的影響，旨在為遠(yuǎn)紅外殺菌工藝的廣泛應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

黃曲霉菌(AspergillusflavusCGMCC 3.4408)：中國微生物菌種保藏管理中心；

粳米：二級，含水率14.31%，上海祥森米業(yè)有限公司;

孟加拉紅培養(yǎng)基：生化試劑，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

乙腈：色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

其他試劑：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

AFB1標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99%，以色列Fementek公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

高效液相色譜儀：Agilent 1100型，德國安捷倫公司；

高效液相色譜儀(配有熒光檢測器)：Waters e2695型，美國Waters公司；

遠(yuǎn)紅外層式烘箱：額定電壓220 V，額定功率1 200 W，利用遠(yuǎn)紅外光波片作為熱源，烘箱內(nèi)有4塊光波片，每塊光波片可單獨控溫，上海熱麗科技集團(tuán)有限公司；

高精度分光測色儀：UltraScan Pro1166型，美國Hunterlab公司；

紫外分光光度計：UV-2600型，日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 將已接種黃曲霉菌孢子的PDA培養(yǎng)基斜面試管置于28 ℃、濕度70%的恒溫恒濕箱中培養(yǎng)7 d，用無菌生理鹽水沖洗斜面并收集孢子，過濾菌絲得到孢子懸液，調(diào)整孢子懸液濃度為106CFU/mL。

稱取適量大米，加入一定體積的孢子菌懸液，分別配制成初始含水率為(30.05±0.33)%和(20.11±0.16)%的樣品，充分搖晃混勻，4 ℃放置24 h，使水分平衡。

1.2.2 紅外和熱風(fēng)處理 參考相關(guān)研究[16-17]和預(yù)試驗結(jié)果確定紅外和熱風(fēng)處理條件：

(1) 大米含水率(30.05±0.33)%，載樣量40 g，單層鋪設(shè)，紅外溫度70 ℃分別處理20，40，60 min；紅外90 ℃處理40 min；紅外100 ℃分別處理10，20，30 min；紅外110 ℃處理10 min，紅外115 ℃分別處理5，10 min，測定大米含水率和黃曲霉菌落數(shù)。

(2) 大米含水率(30.05±0.33)%，載樣量40 g，單層鋪設(shè)，105 ℃熱風(fēng)干燥5 min，測定大米黃曲霉菌落數(shù)。

(3) 大米含水率(20.11±0.16)%，載樣量40 g，單層鋪設(shè)，紅外溫度115 ℃，保溫5 min，降低輻照溫度至70 ℃，分別保溫0，5，15，30 min。測定大米含水率、黃曲霉菌落數(shù)、Lab值、游離氨基酸和可溶性蛋白。

1.2.3 微生物測定 按GB 4789.15—2016的平板計數(shù)法執(zhí)行。

1.2.4 殺菌效率計算 采用微生物殘活率對數(shù)值來表示，按式(1)計算：

(1)

式中：

N——殺菌處理后大米中孢子存活量，CFU/mL；

N0——殺菌處理前大米中孢子總數(shù)，CFU/mL；

lgS——殺菌處理前后孢子總數(shù)降低的對數(shù)即微生物殘存率。

1.2.5 生長曲線測定 將含水率為30%的大米經(jīng)115 ℃紅外輻照5 min，對照組未經(jīng)紅外輻照處理，分別稱取25 g于無菌均質(zhì)袋中，加入225 mL無菌生理鹽水，拍打式均質(zhì)器拍打頻率5次/s，均質(zhì)2 min，收集均質(zhì)液，根據(jù)文獻(xiàn)[16]測定生長曲線。

1.2.6 產(chǎn)毒培養(yǎng)及AFB1提取 收集紅外輻照處理后的大米樣品，混合均勻，將大米表面的黃曲霉孢子洗脫于均質(zhì)液中，吸取5 mL均質(zhì)液于150 mL產(chǎn)毒培養(yǎng)基(參照NY/T 2311—2013)中。28 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)6 d。處理組：含水率為30%和20%的大米經(jīng)115 ℃紅外輻照5 min；對照組：含水率為30%的大米未經(jīng)紅外輻照處理。產(chǎn)毒培養(yǎng)結(jié)束后，參照GB 5009.22—2016測定AFB1。

1.2.7 大米水分測定 按GB 5009.3—2016直接干燥法執(zhí)行。

1.2.8 Lab值的測定 以未處理的大米作為對照，利用高精度分光測色儀測量不同紅外條件處理后的大米的L、a、b值，按式(2)計算△E[18]。

(2)

式中：

△E——色差；

L——亮度；

a——紅綠偏向；

b——黃藍(lán)偏向。

1.2.9 可溶性蛋白的測定 采用考馬斯亮藍(lán)法[19]，牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.947x+0.050 6，R2=0.999。

1.2.10 游離氨基酸測定 稱取1.000 g樣品，5%三氯乙酸定容至10 mL，振蕩1 min，超聲20 min，靜置2 h，定性濾紙過濾，采用鄰苯二甲醛一氯甲酸芴甲酯(OPA-FMOC) 柱前衍生法[20]測定游離氨基酸含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

各試驗至少重復(fù)3次，采用SPSS 19.0和 Origin 9.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析和制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅外輻照對黃曲霉的影響

2.1.1 紅外輻照和熱風(fēng)干燥對大米黃曲霉孢子殺滅效果的影響 由表1可知，大米含水率為30%，輻照溫度為70 ℃，處理20 min和60 min時，殺菌效果沒有顯著增加。輻照溫度高于90 ℃時，紅外輻照殺滅效果隨著設(shè)定溫度的升高和處理時間的延長而增強(qiáng)。當(dāng)輻照溫度為115 ℃處理5 min和10 min時， lgS分別為2.96±0.28，3.85±0.15。高溫短時(115 ℃)處理滅殺效果優(yōu)于低溫長時(70 ℃)處理，與任夢影等[21]采用熱處理大米粉中的霉菌研究結(jié)果一致。由表1、2可知，輻照溫度相同時，含水率越高，孢子更容易失活死亡，這是因為高水分下，孢子對溫度更敏感。紅外115 ℃處理10 min 時，樣品表面溫度較高，大米出現(xiàn)明顯裂紋，感官品質(zhì)及營養(yǎng)品質(zhì)降低，因此高溫處理時間不宜過長。

經(jīng)測定，樣品經(jīng)105 ℃熱風(fēng)干燥5 min后，其表面溫度為(59.0±3.0) ℃，與經(jīng)115 ℃遠(yuǎn)紅外輻照5 min后的表面溫度一致，在此條件下紅外輻照lgS為2.96±0.28，熱風(fēng)處理lgS為1.41±0.21。紅外殺菌效果顯著優(yōu)于熱風(fēng)殺菌。這可能是加熱和DNA損傷重疊效應(yīng)導(dǎo)致了微生物的失活[22]，也可能是遠(yuǎn)紅外的特征吸收效應(yīng)所致。

由表2可知，采用紅外115 ℃輻照5 min后結(jié)合70 ℃保溫，殺菌效果隨著保溫時間的延長而增強(qiáng)，且顯著高于直接采用70 ℃輻照的殺菌效果。Wang等[16]采用催化式紅外加熱對初始水分高于21.1%的稻谷輻射至60 ℃后保溫120 min，黃曲霉菌數(shù)降低8.3 lgS。研究[23]表明采用紅外輻照結(jié)合保溫處理，能增強(qiáng)殺菌效果。紅外高溫短時處理對黃曲霉孢子造成一定程度的損傷，結(jié)合保溫處理能有效殺滅受損孢子。

表1 紅外輻照與熱風(fēng)對初始含水率30%大米殺菌效果的影響(lgS)?

? “-”表示未檢測。

表2紅外輻照結(jié)合保溫對含水率20%大米殺菌效果的影響(lgS)

Table 2 Disinfection effect of FIR irradiation and heating on rice with moisture content of 20% (n=3)

溫度/℃時間/min保溫溫度/℃保溫時間/minlgS11557002.04±0.1711557053.87±0.2211557015>5.5711557030>5.80

2.1.2 紅外輻照對黃曲霉生長曲線的影響 圖1表示未紅外處理的黃曲霉孢子和紅外處理后黃曲霉孢子在液體培養(yǎng)基中生長量的變化。由圖1可知，F(xiàn)IR處理后，黃曲霉菌遲滯期延長，對照組和處理組分別培養(yǎng)12 h和60 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，對數(shù)生長期分別為72 h和36 h。進(jìn)入平穩(wěn)期后，未處理組菌體量顯著高于處理組。這可能是紅外輻照使得一部分黃曲霉孢子死亡而無法繼續(xù)生長，且存活的部分黃曲霉孢子由于紅外輻照的作用受到一定程度的損傷，菌體活力受到影響，導(dǎo)致生長周期和生長量發(fā)生變化。

圖1 紅外輻照對黃曲霉生長曲線的影響

2.1.3 紅外輻照對黃曲霉產(chǎn)AFB1能力的影響 由圖2可知，紅外輻照后，發(fā)酵液中總AFB1含量和單位菌體產(chǎn)毒含量顯著降低。30%含水率大米紅外115 ℃處理5 min后，與對照組相比，AFB1總量下降63.09%，單位菌體產(chǎn)毒量下降38.44%；而20%含水率大米AFB1總量下降55.04%，單位菌體產(chǎn)毒量下降約22.54%。大米含水率越高，黃曲霉產(chǎn)毒含量越低，可能是大米表面的黃曲霉孢子在高水分環(huán)境下處于相對活躍狀態(tài)，抗熱性更差，遠(yuǎn)紅外對黃曲霉孢子損傷越大，產(chǎn)毒能力下降越顯著。丁丁等[24]發(fā)現(xiàn)紫外輻照后黃曲霉菌產(chǎn)AFB1減少，但沒考慮紫外線對霉菌的致死作用也會導(dǎo)致產(chǎn)AFB1總量的減少。AFB1熱分解溫度為237～299 ℃，采用115 ℃輻照溫度處理5 min，不能直接降解AFB1，但能有效抑制黃曲霉菌產(chǎn)毒能力，降低后期糧食污染和霉變風(fēng)險。

同系列中不同字母表示組間差異顯著，P<0.05

2.2 紅外輻照對大米品質(zhì)的影響

2.2.1 紅外輻照對大米含水率的影響 圖3為30%含水率大米在不同溫度不同處理時間后含水率的變化。由圖3可知，紅外輻照溫度越高，干燥速率越大，大米達(dá)到安全水分所需時間越短。大米含水率為30%時，紅外輻照70，80，90，100，105 ℃，分別處理70，60，40，30，30 min，大米可以達(dá)到安全水分14.5%。在干燥后期，不同輻照溫度的干燥速率明顯降低，這是由于后期大米含水率低，水分梯度減小，水分子向表面遷移的速率降低，干燥時間變長[25]。對含水率20%的大米，宜紅外115 ℃輻照5 min后于70 ℃保溫30 min。高溫輻照時，大米水分顯著降低，保溫過程大米水分損失較慢，這是因為在密閉環(huán)境中，受熱蒸發(fā)的水汽難以揮發(fā)，環(huán)境濕度與樣品水分梯度小，樣品中水分子遷移速率降低。采用高溫結(jié)合保溫工藝，既能作為大米高溫處理后的緩蘇工藝，又能延長處理時間，增強(qiáng)殺菌效果，避免大米水分過低引起大米品質(zhì)的降低。

圖3 紅外輻照對大米含水率的影響

2.2.2 紅外輻照對大米色澤的影響 由表3可知，與對照組相比，紅外處理后的大米L值、b值無顯著性差異，含水率30%和20%的大米經(jīng)115 ℃處理5 min后，色度a值和對照組差異顯著，可能是大米初始含水率差異造成的。含水率20%的大米先115 ℃處理5 min后于70 ℃保溫30 min，色度a值升高，說明保溫時間不宜過長。紅外輻照后，大米總色差△E均小于3.0，楊丹等[18]對稻米的研究表明，當(dāng)△E<1.5時，說明樣品與對照組無差異；1.5<△E<3.0時稍有差異；3.0<△E<6.0時有差異；△E>6.0時有顯著差異。說明紅外處理后大米表面色澤變化較小，在可接受范圍內(nèi)。

2.2.3 紅外輻照對大米可溶性蛋白的影響 由表3可知，在一定輻照溫度下，隨著處理時間的延長，大米可溶性蛋白含量逐漸降低。Lv等[26]研究發(fā)現(xiàn)熱處理導(dǎo)致米糠可溶性蛋白溶解度降低。這是因為高溫使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，疏水基團(tuán)暴露，水溶性降低[27]。輻照條件相同時，含水率30%的大米可溶性蛋白含量為(677.03±35.48) μg/g，含水率20%的大米的可溶性蛋白含量為(781.33±18.07) μg/g。這可能是樣品含水率越高，水分子對紅外輻照能量的吸收越多，水分子與蛋白之間的反應(yīng)更劇烈，可溶性蛋白含量減少。可溶性蛋白質(zhì)含量高有利于大米的吸水膨脹和糊化，增加米飯的黏稠度[19]。結(jié)果表明，紅外輻照更有利于對低含水率大米進(jìn)行干燥殺菌處理。

2.2.4 紅外輻照對大米游離氨基酸含量的影響 由表4可知，含水率20%的大米在紅外輻照后結(jié)合保溫，游離氨基酸含量無明顯差異，說明遠(yuǎn)紅外70 ℃保溫對大米游離氨基酸影響不大。當(dāng)紅外輻照條件為115 ℃ 處理5 min時，含水率30%的大米游離氨基酸含量增加，而含水率20%大米的無明顯變化，可能是大米蛋白質(zhì)在高水分環(huán)境下更容易受熱分解生成游離氨基酸，使得游離氨基酸含量增多[28]。

表3 紅外輻照對大米色澤及可溶性蛋白的影響?

? 同列字母不同表示組間差異顯著，P<0.05；樣品1：初始含水率30%大米115 ℃處理5 min；樣品2：初始含水率20%大米115 ℃處理5 min；樣品3：初始含水率20%大米115 ℃處理5 min，70 ℃保溫5 min；樣品4：初始含水率20%大米115 ℃處理5 min，70 ℃保溫15 min；樣品5：初始含水率20%大米115 ℃處理5 min，70 ℃保溫30 min。

續(xù)表4

樣品半胱氨酸纈氨酸甲硫氨酸苯丙氨酸異亮氨酸亮氨酸賴氨酸脯氨酸總量對照0.211.421.981.131.351.651.260.8544.6110.161.662.212.471.641.700.780.8252.7420.171.331.821.911.481.450.050.8342.4330.071.341.920.121.261.350.591.2643.7140.111.391.930.101.441.520.930.7643.5450.101.331.921.571.170.040.561.0944.68

? 1.對照組；2. 初始含水率30%大米115 ℃處理5 min；3. 初始含水率20%大米115 ℃處理5 min；4. 初始含水率20%大米115 ℃處理5 min，70 ℃保溫5 min；5. 初始含水率20%大米115 ℃處理5 min，70 ℃保溫15 min；6. 初始含水率20%大米115 ℃處理5 min，70 ℃保溫30 min。

3 結(jié)論

采用遠(yuǎn)紅外輻照115 ℃處理5 min能有效降低黃曲霉孢子數(shù)量和黃曲霉菌產(chǎn)毒能力，顯著影響黃曲霉生長曲線。采用115 ℃輻照后結(jié)合70 ℃保溫，黃曲霉對數(shù)降低值明顯增加，色差值L、b及△E變化不顯著，游離氨基酸無顯著變化，可溶性蛋白降低。

紅外輻照具有較高的殺菌效率，雖輻照條件不足以直接降解黃曲霉毒素，但能有效降低黃曲霉產(chǎn)AFB1能力，降低黃曲霉和黃曲霉毒素對糧食污染的風(fēng)險。通過改進(jìn)現(xiàn)有工藝，同時實現(xiàn)干燥和殺菌的目的，具有技術(shù)和經(jīng)濟(jì)可行性。

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