南疆傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶中酵母菌的分子鑒定及抗氧化活性研究

古麗娜孜·卡哈爾 努爾古麗·熱合曼 迪麗拜爾·玉山 麥克麗亞·亞力昆

(新疆師范大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830054)

新疆地域遼闊，氣候多樣，向來(lái)就以其豐富的乳制品資源著稱。當(dāng)?shù)氐膫鹘y(tǒng)發(fā)酵酸奶更是歷史悠久，味道可口[1]。傳統(tǒng)發(fā)酵食品的微生物區(qū)系通常有細(xì)菌與酵母菌組成，少數(shù)情況下也有霉菌參與。這些微生物在發(fā)酵過(guò)程中，增添了獨(dú)特的芳香物質(zhì)與層次感[2]。酵母菌在真核微生物群體當(dāng)中所占的數(shù)量龐大，分布廣泛，而且在生物技術(shù)方面擁有多種用途[3-4]。在眾多發(fā)酵食品當(dāng)中酵母菌占有舉足輕重的地位[5]。此外，酵母菌可以從外界環(huán)境中吸取酚類(lèi)物質(zhì)，具有提高自身抗氧化活性的能力[6]，含有豐富的維他命B6、B12以及可以與各種酶類(lèi)有協(xié)同作用的諸多礦物質(zhì)[7]。傳統(tǒng)工業(yè)化生產(chǎn)的酸奶主要發(fā)酵菌是乳酸菌，很少會(huì)將酵母菌添加為發(fā)酵菌，酵母菌一直以來(lái)也被看做是引起產(chǎn)品腐壞的腐敗菌。

在鑒定方面，隨著科學(xué)技術(shù)水平的發(fā)展，26S rDNA及其轉(zhuǎn)錄間區(qū) ITS 的序列分析等技術(shù)被越來(lái)越多地應(yīng)用于酵母菌的分類(lèi)與序列分析當(dāng)中[8-9]。Kurtzman等[10]對(duì)大約500種子囊菌酵母和擔(dān)子菌酵母26S rDNA 中的D1/D2區(qū)域序列進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)該方法可以將絕大部分分離開(kāi)來(lái)。由于這些序列均已公布于GenBank/EM-BL/DDBJ等國(guó)際核酸數(shù)據(jù)庫(kù)，為酵母菌的分子分類(lèi)學(xué)、分子系統(tǒng)學(xué)和多樣性的研究帶來(lái)很大便利[11] 8-9。近年來(lái)，Lachance等[12]發(fā)現(xiàn)Clavisporalusitaniae的26S rDNAD1/D2區(qū)具有顯著的多態(tài)性。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)愈來(lái)愈多的酵母菌中存在個(gè)體基因組ITS和26S rDNA序列多態(tài)性，同一菌株基因組內(nèi)不同類(lèi)型的ITS序列差異也可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)菌種間的差異范圍[13]。因此，僅僅依靠單一序列的鑒定結(jié)果會(huì)有一定程度的不確定性。在抗氧化活性方面，中國(guó)已有利用抗氧化活性酵母在小鼠體內(nèi)進(jìn)行抗衰試驗(yàn)等方面的研究[14]。

本研究擬以新疆阿圖什與烏什的4種酸奶中分離純化得到的78株酵母菌為研究對(duì)象，采用26S rDNA D1/D2區(qū)域及ITS內(nèi)轉(zhuǎn)錄序列擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，并對(duì)其總抗氧化能力，羥基自由基抑制能力、抗超氧陰離子自由基能力以及脂質(zhì)過(guò)氧化物產(chǎn)量進(jìn)行測(cè)定，篩選出具有優(yōu)良抗氧化活性的菌株；通過(guò)雙序列測(cè)序技術(shù)對(duì)分離得到的酵母菌進(jìn)行鑒定，使用MEGA 7.0等生物學(xué)軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，并對(duì)南疆地區(qū)酸奶中的酵母菌抗氧化活性進(jìn)行初篩，為酵母菌資源的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株及其來(lái)源

傳統(tǒng)手工酸奶：阿圖什與烏什地區(qū)農(nóng)民家庭作坊生產(chǎn)，將樣品裝置于無(wú)菌容器，運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后置于4 ℃保藏，從中分離純化得到78株酵母菌，標(biāo)號(hào)，并用20%甘油于-80 ℃超低溫冰箱保種。

1.1.2 儀器與試劑

立式壓力蒸汽滅菌器：LZDZX-30KBS型，上海申安醫(yī)療器械廠；

離心機(jī)：BLF6型，上海一恒科技有限公司；

PCR儀：LNB48+型，上海皓莊儀器有限公司；

分光光度計(jì)：722型，上海菁華科技儀器有限公司；

酵母浸粉、蛋白胨：分析純，北京澳博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；

葡萄糖、瓊脂：分析純，合肥志宏生物技術(shù)有限公司；

酵母菌基因組提取試劑盒：天根生化科技有限公司；

上游引物(NL1、ITS1)、下游引物(NL4、ITS4)：上海生物工程股份有限公司；

總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)定試劑盒(貨號(hào)A015-1)、脂質(zhì)過(guò)氧化(LPO)測(cè)試盒(貨號(hào)A106)、抗超氧陰離子自由基測(cè)試盒(貨號(hào)A052)、羥基自由基測(cè)定試劑盒(貨號(hào)A018)：南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定

(1) 菌種活化：在提取酵母菌基因組DNA之前先對(duì)其進(jìn)行2次活化，將用甘油凍藏(-80 ℃)的酵母菌菌株按照1%的接種量接種于新鮮配置的YPD培養(yǎng)基中(10 g/L 酵母浸粉, 20 g/L蛋白胨，20 g/L 葡萄糖)[15]，28 ℃培養(yǎng)24 h。

(2) 總DNA的提?。篋NA的提取按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，第二步略有改動(dòng)，水浴時(shí)間改為40 min對(duì)酵母菌進(jìn)行破壁處理[16]。

(3) 基因組DNA電泳：提取的DNA采用1.0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電壓80 V，時(shí)長(zhǎng)40 min，在凝膠成像儀中觀察凝膠。

(4) 26S rDNA D1/D2區(qū)PCR擴(kuò)增：酵母菌PCR擴(kuò)增體系見(jiàn)表1，引物為通用引物,正向引物NL1：(5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’)，反向引物NL4：(5’-GGTCCGTGTTTCA AGACGG-3’)。

表1 26S rDNA D1/D2區(qū) PCR擴(kuò)增體系[18]

擴(kuò)增循環(huán)為95 ℃ 5 min，預(yù)變性，94 ℃ 1 min、52 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，36個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸8 min[17]。擴(kuò)增結(jié)束后取4 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與Golden viewer核酸染料混合點(diǎn)樣，用(1×TAE)緩沖液制備2.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，擴(kuò)增成功在600 bp左右形成可見(jiàn)條帶。PCR產(chǎn)物被送到新疆昆泰銳生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

(5) ITS序列PCR擴(kuò)增：ITS PCR擴(kuò)增體系見(jiàn)表2，引物采用ITS通用擴(kuò)增引物，正向引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)，反向引物ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)。

表2 ITS PCR擴(kuò)增體系[18]16

擴(kuò)增循環(huán)為95 ℃ 5 min預(yù)變性，94 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、72 ℃ 1.5 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min[18]15-16。擴(kuò)增結(jié)束后取4 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與Golden viewer核酸染料混合點(diǎn)樣，用(1×TAE)緩沖液制備2.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，擴(kuò)增成功在400～700 bp左右形成可見(jiàn)條帶[19]。PCR產(chǎn)物被送到新疆昆泰銳生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

(6) 同源性分析：利用MEGA7.0 軟件，對(duì)被測(cè)酵母菌的26S rDNA D1/D2區(qū)域、ITS序列以及GenBank中比對(duì)獲得的參比菌株序列進(jìn)行同源性分析，申請(qǐng)菌株登錄號(hào)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.2.2 酵母菌抗氧化活性檢測(cè)

(1) 酵母菌細(xì)胞的收集：將-80 ℃下甘油保藏的菌株進(jìn)行活化，將活化好的酵母菌10 000 r/min離心10 min收集細(xì)胞。

(2) 酵母細(xì)胞預(yù)處理：將離心收集的細(xì)胞用無(wú)菌水洗滌3～5次后進(jìn)行冷凍干燥(-48 ℃，4 Pa)，凍干細(xì)胞備用。利用反復(fù)凍融超聲破碎法[20]提取粗酶液。

(3) 抗氧化能力檢測(cè)：菌株總抗氧化能力(T-AOC)檢測(cè)[21]、羥基自由基抑制能力檢測(cè)、抗超氧陰離子自由基能力測(cè)試以及產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化物(LPO)含量測(cè)試均以南京建成測(cè)定試劑盒步驟進(jìn)行，每個(gè)樣品均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 26S rDNA序列分析結(jié)果

分別采用78株菌的基因組序列為模板，采用引物NL1、NL4擴(kuò)增出26S rDNA D1/D2序列，利用2.0%濃度的瓊脂糖凝膠對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，大小約為600 bp(圖1)。擴(kuò)增序列片段經(jīng)測(cè)序后，通過(guò)BIOEDIT生物軟件整理數(shù)據(jù)并在GenBank 中進(jìn)行BLAST同源序列搜索，對(duì)同源性高的相似菌株序列進(jìn)行下載。結(jié)果表明，78株酵母菌的26S rDNAD1/D2區(qū)域基因序列同源性均≥99%，菌株登錄號(hào)及名稱見(jiàn)表3。

圖1 部分菌株26S rDNA D1/D2區(qū)域序列電泳圖

隨后利用MEGA7.0對(duì)序列繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)(圖2)。結(jié)果表明，阿圖什與烏什縣傳統(tǒng)發(fā)酵乳當(dāng)中的酵母菌共屬于3個(gè)屬3個(gè)種，其中3個(gè)屬分別為酵母屬(Saccharomycescerevisiae)、克魯維酵母屬(Kluyveromycesmarxianus)、畢赤酵母屬(Pichiakudriavzevii)；3個(gè)種為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、馬克思克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)、庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)。

2.2 ITS序列分析結(jié)果

同樣采用78株酵母菌基因序列為模板，利用ITS1與ITS4引物對(duì)ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增，將產(chǎn)物用濃度2.0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，發(fā)現(xiàn)在400～700 bp處出現(xiàn)條帶(圖3)，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序后，通過(guò)BIOEDIT生物軟件整理數(shù)據(jù)并在GenBank 中進(jìn)行BLAST同源序列搜索，對(duì)同源性高的相似菌株序列進(jìn)行下載。結(jié)果表明，78株酵母菌的ITS區(qū)域基因序列同源性均≥98%，與26S rDNA結(jié)果一致，菌株相似性比較結(jié)果見(jiàn)表4。

同樣利用MEGA7.0軟件繪制菌株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)(圖4)，結(jié)果表明，78株菌分屬于釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、馬克思克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)、畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)。其中NG-98、NG-M66、NG-Y36 3株酵母菌ITS序列相似性只有98%，需通過(guò)TA克隆進(jìn)行進(jìn)一步研究。

表3 菌株名稱及登錄號(hào)

2.3 抗氧化能力篩選

2.3.1 總抗氧化能力(T-AOC) 本試驗(yàn)通過(guò)總抗氧化能力試劑盒，最終測(cè)定出78株菌株中42株具有抗氧化活性，見(jiàn)圖5。

通過(guò)圖5可以看出，42株酵母中NG-Y50號(hào)菌抗氧化活性最高，為(107.33±2.97) U/mL；NG-L18號(hào)菌株抗氧化活性最低，僅為(4.29±2.84)U/mL。高于平均值的菌株有NG-40、NG-41、NG-54、NG-56、NG-57、NG-58、NG-87、NG-105、NG-L1、NG-Y50、NG-M60、NG-M66。

圖3 部分菌株ITS序列PCR產(chǎn)物電泳圖

分離菌株登錄號(hào)相似菌株分離菌株登錄號(hào)相似菌株NG-4KY888043Kluyveromyces marxianusNG-89KY888082Kluyveromyces marxianusNG-12KY888044Kluyveromyces marxianusNG-92KY888083Kluyveromyces marxianusNG-15KY888045Pichia kudriavzeviiNG-93KY888084Saccharomyces cerevisiaeNG-16KY888046Saccharomyces cerevisiaeNG-94KY888085Pichia kudriavzeviNG-21KY888047Saccharomyces cerevisiaeNG-95KY888086Kluyveromyces marxianusNG-30KY888048Kluyveromyces marxianusNG-97KY888087Saccharomyces cerevisiaeNG-31KY888049Kluyveromyces marxianusNG-98KY888088Pichia kudriavzeviiNG-33KY888050Saccharomyces cerevisiaeNG-99KY888089Kluyveromyces marxianusNG-36KY888051Kluyveromyces marxianusNG-100KY888090Kluyveromyces marxianusNG-38KY888052Kluyveromyces marxianusNG-101KY888091Kluyveromyces marxianusNG-39KY888053Kluyveromyces marxianusNG-102KY888092Saccharomyces cerevisiaeNG-40KY888054Kluyveromyces marxianusNG-103KY888093Saccharomyces cerevisiaeNG-41KY888055Kluyveromyces marxianusNG-104KY888094Kluyveromyces marxianusNG-42KY888056Kluyveromyces marxianusNG-105KY888095Saccharomyces cerevisiaeNG-43KY888057Kluyveromyces marxianusNG-106KY888096Kluyveromyces marxianusNG-44KY888058Kluyveromyces marxianusNG-136KY888097Kluyveromyces marxianusNG-45KY888059Kluyveromyces marxianusNG-L1KY888098Saccharomyces cerevisiaeNG-47KY888060Saccharomyces cerevisiaeNG-L8KY888099Saccharomyces cerevisiaeNG-48KY888061Kluyveromyces marxianusNG-L9KY888100Saccharomyces cerevisiaeNG-51KY888062Kluyveromyces marxianusNG-L13KY888101Saccharomyces cerevisiaeNG-53KY888063Kluyveromyces marxianusNG-L14KY888102Saccharomyces cerevisiaeNG-54KY888064Saccharomyces cerevisiaeNG-L17KY888103Saccharomyces cerevisiaeNG-56KY888065Kluyveromyces marxianusNG-L18KY888104Saccharomyces cerevisiaeNG-57KY888066Saccharomyces cerevisiaeNG-L27KY888105Saccharomyces cerevisiaeNG-58KY888067Kluyveromyces marxianusNG-L28KY888106Saccharomyces cerevisiaeNG-61KY888068Kluyveromyces marxianusNG-L29KY888107Saccharomyces cerevisiaeNG-69KY888069Kluyveromyces marxianusNG-M51KY888108Saccharomyces cerevisiaeNG-72KY888070Saccharomyces cerevisiaeNG-M60KY888109Saccharomyces cerevisiaeNG-78KY888071Kluyveromyces marxianusNG-M61KY888110Saccharomyces cerevisiaeNG-79KY888072Pichia kudriavzeviiNG-M66KY888111Saccharomyces cerevisiaeNG-80KY888073Kluyveromyces marxianusNG-Y31KY888112Saccharomyces cerevisiaeNG-81KY888074Saccharomyces cerevisiaeNG-Y33KY888113Saccharomyces cerevisiaeNG-82KY888075Kluyveromyces marxianusNG-Y34KY888114Saccharomyces cerevisiaeNG-83KY888076Kluyveromyces marxianusNG-Y35KY888115Saccharomyces cerevisiaeNG-84KY888077Kluyveromyces marxianusNG-Y36KY888116Saccharomyces cerevisiaeNG-85KY888078Saccharomyces cerevisiaeNG-Y38KY888117Saccharomyces cerevisiaeNG-86KY888079Kluyveromyces marxianusNG-Y39KY888118Saccharomyces cerevisiaeNG-87KY888080Kluyveromyces marxianusNG-Y45KY888119Saccharomyces cerevisiaeNG-88KY888081Saccharomyces cerevisiaeNG-Y50KY888120Saccharomyces cerevisiae

2.3.2 羥基自由基抑制能力 通過(guò)羥基自由基測(cè)定試劑盒對(duì)具有抗氧化活性的42株酵母菌進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖6。

由圖6可知，在測(cè)試的這42株菌株中NG-M61號(hào)菌株抑制羥基自由基能力最高，為(755.80±3.63) U/mL；NG-M60號(hào)菌株抑制羥基自由基能力最低，僅為(60.46±4.66) U/mL。其中抑制羥自由基能力高于平均值的菌株有NG-15、NG-30、NG-33、NG-40、NG-41、NG-45、NG-53、NG-57、NG-58、NG-72、NG-84、NG-92、NG-93、NG-105、NG-106、NG-L1、NG-L13、NG-Y39、NG-Y50、NG-M51、NG-M61。對(duì)篩選抗氧化能力以及抑制羥基自由基能力均高于平均值的7株酵母菌進(jìn)行抗超氧陰離子自由基測(cè)定以及脂質(zhì)過(guò)氧化物(LPO)含量測(cè)試。

圖4 部分菌株ITS序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

圖5 具有抗氧化活性的菌株及其抗氧化能力

圖6 42株酵母菌羥基自由基抑制能力

2.3.3 抗超氧陰離子自由基能力 抗超氧陰離子自由基能力見(jiàn)圖7。

由圖7可以看出，7株酵母菌中NG-105號(hào)菌株的抗超氧陰離子自由基能力最強(qiáng)[(134.29±1.72) U/mL]，NG-58號(hào)菌株最弱[(35.53±4.66) U/mL]。

2.3.4 脂質(zhì)過(guò)氧化物含量 脂質(zhì)過(guò)氧化物含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖8。

由圖8可知，本研究所測(cè)試的7株酵母菌，產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化物的含量偏低，脂質(zhì)過(guò)氧化物含量最高的菌株NG-Y57所產(chǎn)生的LPO值也僅為(4.97±0.11) μmol/L，而含量最低的菌株NG-105產(chǎn)生的LPO值只有(0.32±0.14) μmol/L。

由表5可以看出，NG-Y50號(hào)菌株抗氧化活性最高，抑制羥基自由基能力為(648.73±4.81) U/L，但是其抗超氧陰離子能力[(40.36±4.56) U/mL]不及NG-40，而且NG-40號(hào)菌株抗氧化活性為(106.41±3.92) U/mL，抑制羥基自由基能力為(651.24±3.75) U/L，抗超氧陰離子能力為(104.11±3.25) U/mL，而其所含有的脂質(zhì)過(guò)氧化物含量?jī)H有(1.99±0.65) μmol/L。綜上所述，NG-40具有較強(qiáng)的抑制自由基能力，可被開(kāi)發(fā)為新型抗氧化活劑。這株菌被鑒定為馬克思克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)。

圖7 抗超氧陰離子自由基能力

3 結(jié)論

(1) 本研究對(duì)酸奶中的酵母菌進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果表明，38株屬于釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，36株屬于馬克思克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)，4株屬于畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)。Gabriela Diosma等[22]對(duì)開(kāi)菲爾樣品中分離出的酵母菌進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)它們屬于Saccharomycescerevisiae，Saccharomycesunisporus，Issatchenkiaoccidentalis，Kluyveromycesmarxianus4種酵母。但本試驗(yàn)的樣品中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Saccharomycesunisporus以及Issatchenkiaoccidentalis等酵母菌種，這與樣品的地域性以及種類(lèi)有關(guān)。 Yang等[23]以西藏牦牛酸奶為對(duì)象，對(duì)其中的酵母菌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)它們同樣屬于釀酒酵母，馬克思克魯維酵母與畢赤酵母。李靜等[24]對(duì)新疆酸駝乳進(jìn)行研究時(shí)也同樣分離出這3種酵母。由此可見(jiàn)馬克思克魯維酵母與釀酒酵母在傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中很常見(jiàn)。

圖8 菌株脂質(zhì)過(guò)氧化物(LPO)含量測(cè)定

菌株號(hào)總抗氧化活性/(U?mL-1)抑制羥基自由基能力/(U?L-1)抗超氧陰離子自由基能力/(U?mL-1)脂質(zhì)過(guò)氧化物含量/(μmol?L-1)NG-40106.41±3.92651.24±3.75104.11±3.251.99±0.65NG-4157.41±0.98731.86±1.2795.00±1.873.20±0.80NG-5792.61±3.74628.57±4.9858.93±3.444.97±0.11NG-5880.19±2.57704.16±3.8835.53±4.661.49±0.56NG-10590.47±4.35561.78±4.65134.29±1.720.32±0.14NG-L137.57±4.09745.72±4.00117.14±4.631.84±0.91NG-Y50107.33±2.97648.73±4.8140.36±4.562.08±0.31

(2) 通過(guò)抗氧化活性試劑盒從78株酵母中篩選出7株高抗氧活性酵母，其中NG-40、NG-41、NG-58為馬克思克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)，NG-57、NG-105、NG-L1、NG-Y50為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。戴玥等[25]通過(guò)超氧陰離子清除率等試驗(yàn)選出具有高抗氧能力的假絲酵母Y1，其羥基自由基清除能力超過(guò)40%。韋琰琰[26]從食品中篩選到1株具有高抗氧化活性的酵母菌Y11，并將其鑒定為Aureobasidiumpullulans。這些研究結(jié)果與本研究結(jié)果相一致，說(shuō)明酵母菌具有抑制和清除某些自由基的能力。在發(fā)酵食品中，釀酒酵母與馬克思克魯維酵母對(duì)食物風(fēng)味做出的貢獻(xiàn)較大[11]37-39[18]47-48，而畢赤酵母一般因其產(chǎn)氣效應(yīng)被視為污染菌[15]，本試驗(yàn)中篩選出抗氧化活性較高的7株酵母中也未發(fā)現(xiàn)畢赤酵母。

(3) 關(guān)于這78株酵母菌的生理生化特性以及對(duì)新疆傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品風(fēng)味方面的作用有待進(jìn)一步研究。

[1] 秦艷婷. 新疆地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌的分離鑒定及生物多樣性分析[D]. 呼和浩特: 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014: 1-15.

[2] BUCHL N R, SEILER H. Yeasts and molds-yeasts in milk and dairy products[M]. Technische Universitat, Munchen, Germ-any, 2011: 2 761-2 769.

[3] GARCIA Hernandez, RODRIGUEZ Y, BRANDAO Z, et al . Identification and in vitro screening of avian yeasts for use as probiotic[J]. Research In Veterinary Science, 2012(93)： 798-802.

[4] LABRIE H R, FLISS S. Antimicrobial and probiotic properties of yeasts: from fundamental to novel applications[J]. Frontiers in Microbiology, 2012(3)： 416-421.

[5] ARROYO Lopez, ROMERO F N, et al. Potential benefits of the application of yeast starters in table olive processing[J]. Frontiers in Microbiology, 2012(5)： 34-38.

[6] VENTRICE R M, VARONE D, SIDARI M A, et al. HPLC determination of phenolics adsorbed on yeasts. [J]. Pharm Biomed Anal, 2006, 42(1): 46-55.

[7] CAMARGO G L, GIANETI F, CAMPOS M. Evaluation of dermatological effects of cosmetic formulations containingSaccharomycescerevisiaeextract and vitamins [J]. Food Chem Toxicol, 2008, 46(11): 3 493-3 500.

[8] RAWAT S. Food spoilage: microorganisms and their prevention[J]. Asian Journal of Plant Science and Researc, 2015, 5(4): 47-56.

[9] ANTUNES J, AGUIAR C. Search for killer phenotypes with potential forbiological control[J]. Annals of Microbiology, 2012, 62: 427-433.

[10] KURTZMAN C P, ROBNEL C J. Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from nalysis of nuclear large subunit (26S) ribosomal DNA partial sequences[J]. Antonie van Leeuwenhoek, 1998, 73: 331-371.

[11] 吳陽(yáng). 賽里木酸奶中酵母菌篩選鑒定及發(fā)酵特性研究[D]. 南京： 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012.

[12] LACHANCE M A, DANIEL H M. The D1/D2 domain of the large_subunit rDNA of the yeast speciesClavisporalusitaniaeisunusually polymorphic[J]. FEMS Yeast Research, 2003, 4：253-258．

[13] 王慶國(guó), 劉天明. 酵母菌分類(lèi)學(xué)方法研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)雜志, 2007, 27(3): 96-100.

[14] 陳君, 劉紅芳, 徐靚, 等. 抗氧化酵母菌對(duì)小鼠的抗衰老作用初探[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 35(6): 1 284-1 289.

[15] CAURE Portugal, PINTO L. Potential spoilage yeasts in winery environments: Characterization and proteomic analysis ofTrigonopsiscantarellii[J]. International Journal of Food Microbiology, 2015: 113-12.

[16]李紹蘭， 周斌， 等. 真菌DNA提取方法的改良[J]. 云南大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版， 2002， 24(6)： 471-472.

[17] 謝婕， 趙欣， 等. 傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳中酵母菌的分子生物學(xué)鑒定[J]. 食品科學(xué), 2015, 36(11): 114-118.

[18] 吐汗姑麗·托合提. 拜城賽里木拉絲酸奶微生物多樣性分子解析及其益生特性研究[D]. 烏魯木齊： 新疆師范大學(xué), 2015: 1-39.

[19] KURTZMAN C P. Use of gene sequence analyses and genome comparisons for yeast systematics[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2014, 64: 325-332.

[20] 尹亞輝， 安文濤， 董亮， 等. 不同世代釀酒酵母胞內(nèi)抗氧化酶活性變化[J]. 食品科技， 2013, 38(8): 38-41.

[21] 曾文. 疏花水柏枝內(nèi)生真菌抗氧化能力分析及應(yīng)用[D]. 宜昌： 三峽大學(xué), 2015: 1-15.

[22] GABRIELA Diosma. DAVID E Romanin. Yeasts from kefir grains: isolation, identification, and probiotic characterization[J]. World J Microbiol Biotechnol, 2014, 30: 43-53.

[23] YANG Jun-jun, GUO Chun-feng. Isolation and identification of yeast in yak milk dreg of Tibet in China[J]. Dairy Sci. & Technol, 2014(94): 455-467.

[24] 李靜， 石靜. 新疆酸駝乳中酵母菌的生理生化鑒定及初步應(yīng)用[J]. 中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng), 2012， 18(1)： 22-27.

[25] 戴玥， 余曉斌. 抗氧化菌的篩選及混菌發(fā)酵紅景天條件優(yōu)化[J]. 日用化學(xué)工業(yè)， 2017, 47(7): 408-413.

[26] 韋琰琰. 食品中具有抗氧化活性的酵母菌的篩選及其特性的初步研究[D]. 武漢： 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2013: 1-28.