中華鱉fut2基因的克隆及其組織表達(dá)模式分析

邢 瀟，宋如昕

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

動物腸道既要防止腸道菌群的入侵，同時也要避免對腸道微生物過度免疫反應(yīng)，因此，腸道微生物的種類和數(shù)目要維持一個平衡狀態(tài)[1]。但是有眾多的理化與病理因素可能使腸道微生物異常，例如抗生素、飲食結(jié)構(gòu)的改變以及各種脅迫均會導(dǎo)致腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[2-4]。腸道微生物可以影響宿主的代謝、營養(yǎng)吸收和免疫功能，菌群的失衡會給宿主的健康帶來嚴(yán)重影響。研究表明，腸道菌群可以通過腸-腦軸對宿主的應(yīng)激反應(yīng)、焦慮、抑郁和認(rèn)知功能造成重要影響[5-7]。因此，中華鱉腸道菌群的失衡會嚴(yán)重制約中華鱉的健康生產(chǎn)，從而對中華鱉養(yǎng)殖戶造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（fucosyltransferase，F(xiàn)UTs）能夠催化巖藻糖的形成，主要表達(dá)在胃腸黏液腺中[8]。巖藻糖能夠決定組織血型抗原的形成，是多種腸道微生物的黏附受體[9-10]。因此，F(xiàn)UT2的缺失或異常表達(dá)會影響組織血型抗原的表達(dá)，從而影響腸道細(xì)菌的組成，嚴(yán)重影響宿主的代謝和免疫等功能。

本研究利用PCR技術(shù)擴(kuò)增中華鱉fut2基因的cDNA全長序列，通過生物信息學(xué)分析預(yù)測fut2相關(guān)理化性質(zhì)，同時用Real-time PCR技術(shù)分析fut2基因在中華鱉不同組織中的表達(dá)差異，旨在為將來研究fut2基因打下基礎(chǔ)，對于中華鱉人工養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展以及資源的恢復(fù)具有一定的意義。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

中華鱉購自河北省玉田縣中華鱉養(yǎng)殖場，買回后在實驗室馴養(yǎng)14 d，每日進(jìn)行一次換水喂食，水溫用加熱棒控制在（25±1）℃，取材方法同宋如昕等的方法[11]。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA的反轉(zhuǎn)錄 RNA的提取采用山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院非生物脅迫的細(xì)胞分子生物學(xué)效應(yīng)與適應(yīng)生物學(xué)實驗室總結(jié)的方法[12]，用Trizol提取。采用紫外分光光度計測量RNA的濃度，將合格的RNA樣品調(diào)成統(tǒng)一濃度，將其放入超低溫冰箱中保存，隨后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2 中華鱉fut2基因cDNA全長的獲得 對中華鱉fut2基因序列進(jìn)行預(yù)測，在保守區(qū)設(shè)計引物并合成。使用SMARTer RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒，以中華鱉的混合樣品cDNA為模板進(jìn)行RACE。RACE產(chǎn)物跑膠檢測，對預(yù)測的fut2條帶進(jìn)行切膠回收，連接到載體上，然后轉(zhuǎn)化，挑單克隆培養(yǎng)，菌液PCR篩選后測序，測序結(jié)果在BioEdit中進(jìn)行拼接，根據(jù)拼接得到的序列設(shè)計fut2 cDNA全長驗證引物，經(jīng)驗證后獲得中華鱉fut2 cDNA全長序列。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 在NCBI的Blastp中對中華鱉fut2進(jìn)行同源性比對；使用Signal P 4.1 server預(yù)測信號肽；蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)采用SOPMA在線軟件預(yù)測，相似性以及一致性利用NCBI數(shù)據(jù)庫分析。用ORF Finder推測其ORF及所編碼的氨基酸序列；在ProtParam tool中分期FUT2氨基酸序列的等電點(diǎn)和親水性；跨膜結(jié)構(gòu)的分析則用TMHMM軟件；利用SMART數(shù)據(jù)庫分析結(jié)構(gòu)域；用中華鱉fut2的氨基酸序列與其他動物的蛋白序列進(jìn)行比對。采用ClustalX軟件和MEGA 6.0軟件，構(gòu)建中華鱉FUT2氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹。蛋白3D結(jié)構(gòu)預(yù)測采用同源建模法，用SWISS-MODEL在線軟件完成。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測 根據(jù)獲得的中華鱉fut2基因的全長，熒光定量引物fut2 Fwd，fut2 Rev（表1）在Primer 3.0在線軟件中進(jìn)行設(shè)計。以反轉(zhuǎn)錄各組織的cDNA為模板，ef1α為內(nèi)參基因。反應(yīng)體系為：去離子水 3.75 μL，正向引物 0.375 μL，反向引物 0.375 μL，SYBR 7.5 μL。使用熒光定量PCR 儀檢測 Ct值，用 2-ΔΔCt法對結(jié)果進(jìn)行分析，計算各個基因的相對表達(dá)量，通過Graphpad軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并導(dǎo)出柱狀圖。

表1 引物序列

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)處理和柱狀圖的繪制使用Graphpad軟件，統(tǒng)計分析采用SPSS 17.0軟件，差異顯著水平檢驗采用單因素方差分析（one-way ANOVA），顯著水平設(shè)為P＜0.05（任何2組含有同一字母，表示該2組之間差異不顯著，反之，則表示差異顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學(xué)分析

將測序結(jié)果拼接獲得完整的中華鱉fut2基因，全長 1 918 bp，其中，5′非編碼區(qū)（5′-UTR）380 bp，3′非編碼區(qū)（3′-UTR）518 bp，開放閱讀框長度為1 020 bp，編碼339個氨基酸殘基。分析顯示，中華鱉FUT2包含F(xiàn)UT核心結(jié)構(gòu)，屬于O-FucT-like蛋白家族（圖1）。

ProtParam tool分析表明，F(xiàn)UT2蛋白分子量為3.9 ku，理論等電點(diǎn)為8.99。帶有負(fù)電的氨基酸殘基為31個（Asp和Glu），帶有正電的氨基酸殘基為36個（Arg和 Lys），不穩(wěn)定系數(shù)為 48.45，總平均親水性為-0.273，脂溶指數(shù)為79.09。

采用Signal P 4.1 Server預(yù)測蛋白質(zhì)序列中的信號肽的剪切位點(diǎn),結(jié)果顯示,中華鱉fut2基因編碼的蛋白不含有信號肽。通過Target P 1.1 server進(jìn)行導(dǎo)肽查找，結(jié)果顯示，線粒體目標(biāo)肽及分泌途徑信號肽分別為 0.129（mTP）和 0.882（SP），預(yù)測可靠性為2，推測該序列不是定位于線粒體。使用TMHMM在線軟件進(jìn)行分析可知，fut2基因翻譯的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中有1個跨膜結(jié)構(gòu),位于第13～32位氨基酸（圖2）。利用SMART數(shù)據(jù)庫對結(jié)構(gòu)域檢測分析顯示，F(xiàn)UT2包含一個Glyco_transf_11結(jié)構(gòu)域。

FUT2蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要由α螺旋和無規(guī)則卷曲組成，分別占46.90%和28.32%。同時在SWISS-MODEL網(wǎng)構(gòu)建了中華鱉FUT2蛋白的3D模型，如圖3所示。

2.2 中華鱉fut2基因的同源性分析

GenBank數(shù)據(jù)分析顯示（表2），中華鱉FUT2與揚(yáng)子鱷（Alligator sinensis）的相似性（87%）、一致性（81%）最高，與西部錦龜（Chrysemys picta bellii）的相似性為87%、一致性為79%，與安樂蜥（Anolis carolinensis）的相似性為86%、一致性為74%，與綠海龜（Chelonia mydas）的相似性為84%、一致性為76%，與壁虎（Gekko japonicus）的相似性為 79%、一致性為76%，與小鼠（Mus musculus）的相似性為79%、一致性為69%，與人（Homo sapiens）的相似性為76%、一致性為65%。將中華鱉的FUT2氨基酸序列與其他幾種脊椎動物FUT2氨基酸序列對比得出，中華鱉FUT2氨基酸序列相對較保守（圖4）。

表2 中華鱉FUT2編碼氨基酸與其他物種的相似性和一致性分析結(jié)果

采用鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹表明（圖5），中華鱉FUT2單獨(dú)聚為一支，再與西部錦龜和綠海龜聚為一支，然后與揚(yáng)子鱷聚在一起，再與壁虎和安樂蜥聚在一起，它們同屬于脊索動物門爬行綱，而與小鼠和人親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。說明中華鱉fut2基因的分子進(jìn)化地位與其生物學(xué)分類大體一致。

2.3 中華鱉fut2基因的表達(dá)

Real-time PCR結(jié)果顯示，中華鱉fut2在所檢測的各個組織中均有表達(dá)。其中，在心臟中表達(dá)量最高，在腦組織中表達(dá)量最低，在中華鱉腦組織中fut2的表達(dá)量顯著低于回腸后段、肝臟、肌肉和心臟；在回腸后段、大腸、肺、脾臟和肝臟中表達(dá)量適中（圖 6）。

3 討論

巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是一類己糖基轉(zhuǎn)移酶，作為一種關(guān)鍵性酶類，在人類疾病發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。例如，F(xiàn)UT2可能會影響大腸桿菌在腸道的黏附過程[13]，從而影響動物的健康。同時有研究表明，腸道上皮中巖藻糖的缺乏可以改變腸道上皮的通透性，會造成腸道菌群經(jīng)肝門循環(huán)到達(dá)肝臟，造成肝臟細(xì)菌感染[14]。此外，有眾多研究表明，F(xiàn)UT2與潰瘍性結(jié)腸炎和急性腸胃炎關(guān)系密切[15-17]。

本研究利用RACE技術(shù)，首次獲得了中華鱉fut2基因全長，通過對中華鱉fut2基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，中華鱉FUT2蛋白屬于脂溶性蛋白。對蛋白結(jié)構(gòu)和信號肽進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，中華鱉FUT2蛋白無信號肽，但存在一個跨膜結(jié)構(gòu)，說明中華鱉FUT2蛋白不是分泌型蛋白，與欽偉云等[18]研究東串豬FUT2的氨基酸序列結(jié)果相似。多序列比對后發(fā)現(xiàn)，中華鱉fut2基因具有高保守性，系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，在進(jìn)化過程中保守性較高，與其他物種的相似性在76%～87%,中華鱉與西部錦龜?shù)扰佬袆游镉H緣關(guān)系較近，與人和小鼠親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，表明中華鱉的fut2基因符合其進(jìn)化順序。

研究fut2基因在中華鱉組織中表達(dá)分布，有利于更好地了解fut2基因的功能。因此，本研究選擇8只中華鱉分析fut2基因在其組織中的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，fut2基因在中華鱉所檢測組織中都進(jìn)行了表達(dá)，表明fut2基因具有廣泛的組織表達(dá)特征，在中華鱉的生長過程中可能起著十分重要的作用。研究表明，fut2僅限制性表達(dá)在內(nèi)胚層起源的胃腸上皮和唾液腺[19]，這與fut2在中華鱉各組織中的表達(dá)模式相似。

綜上所述，本研究報道了中華鱉fut2基因的分子特征，并對其組織特異性表達(dá)進(jìn)行了相關(guān)研究，但由于腸道菌群結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，具體fut2基因在中華鱉腸道微生物中的功能和調(diào)節(jié)機(jī)制等仍需進(jìn)一步地深入研究。

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