提高保乳手術(shù)冷凍切片質(zhì)量的技術(shù)探討

董蕓蓉

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，治療主要采用外科手術(shù)的方式。早期乳腺癌實(shí)施保乳手術(shù)可有效減少患者的痛苦，提高生活質(zhì)量，減少手術(shù)并發(fā)癥，且能獲得與改良根治術(shù)相同的長(zhǎng)期生存率，故保乳手術(shù)日益得到臨床與廣大患者的青睞。術(shù)中快速冷凍病理診斷在保乳手術(shù)中對(duì)確定腫塊的性質(zhì)，明確切緣的狀況及前哨淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移起著至關(guān)重要的作用，繼而為臨床醫(yī)師決定手術(shù)方案提供可靠的依據(jù)。本文通過回顧性分析，探討如何提高保乳手術(shù)冷凍切片的質(zhì)量?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1材料 選取2017年1－6月寧波市臨床病理診斷中心術(shù)中送檢保乳手術(shù)標(biāo)本（包括前哨淋巴結(jié)、腫塊、切緣）80例，對(duì)其進(jìn)行回顧性研究總結(jié)。

1.2儀器及試劑 ThermoCryotomeFSE冷凍切片機(jī)，Leica819刀片，包埋劑（普通膠水），固定液（甲醇），梯度乙醇，二甲苯，Baso蘇木精染液，Baso醇溶性伊紅染液，均購(gòu)置珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

1.3方法 切片機(jī)速凍臺(tái)溫度設(shè)置在－40℃左右，箱體及凍頭溫度設(shè)置在－15℃左右，具體根據(jù)組織類型不同作適當(dāng)調(diào)節(jié)。送檢組織規(guī)范取材后，用吸水紙將組織表面的血性液體吸干，在預(yù)冷的標(biāo)本托上涂少量包埋劑，待包埋劑底部變白即放入組織，加蓋少量包埋劑，輕輕壓上速凍錘，待組織能與速凍錘分開后即可進(jìn)行切片。將標(biāo)本托固定在切片機(jī)的凍頭上，先利用冷凍箱左側(cè)的快進(jìn)退鍵按鈕使組織塊恰好位于切片刀的后方，先進(jìn)行粗修，暴露至組織最大面，即可進(jìn)行細(xì)修切片。良好的切片便在防卷板下方形成一張完整平坦且無(wú)皺褶的薄片，若切片略有彎曲可用小毛筆輕輕展平切片，打開放卷板，用載玻片平穩(wěn)地輕壓組織，使其平整地吸附到載玻片上[1]，貼片完成后立即入固定液中固定1 m in，行常規(guī)HE染色。

2　結(jié)果

切片完整，厚薄均勻，無(wú)皺褶及裂痕，組織結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)冰晶形成，染色鮮艷，核質(zhì)分明，脫水透明潔凈，封裱美觀（圖1～ 2）。

3　討論

冷凍切片是指新鮮組織不經(jīng)任何固定脫水等處理，直接在低溫恒冷切片機(jī)冷凍后馬上進(jìn)行切片的一種技術(shù)[2]，其目的是在短時(shí)間內(nèi)作出準(zhǔn)確的病理診斷，而切片質(zhì)量的保證，除組織規(guī)范取材外，與組織的速凍包埋、切片的溫度、切片的技巧及染色等因素是密不可分的。

3.1取材 送檢標(biāo)本必須新鮮無(wú)固定，取材時(shí)應(yīng)務(wù)必保持取材臺(tái)面及取材器械的干燥，嚴(yán)禁用流水沖洗標(biāo)本，如遇水時(shí)，用干紗布或吸水紙將組織吸干，以免產(chǎn)生冰晶。（1）前哨淋巴結(jié)：淋巴結(jié)最大徑＞0.5 cm，則應(yīng)剖開取材，同時(shí)應(yīng)盡量將其周圍無(wú)診斷意義的脂肪組織剔除干凈，因脂肪組織的冷凍溫度低于淋巴結(jié)組織，兩者的冷凍時(shí)間不一致，當(dāng)淋巴結(jié)組織凍好時(shí)，脂肪組織還未凍上，導(dǎo)致切片時(shí)被膜不完整。（2）腫塊：取材大小應(yīng)以 1.5 cm×1.5 cm×0.2 cm 為佳，平整，厚薄均勻，病變不夠典型時(shí)可適當(dāng)增加取材，夾雜在腫塊中間的脂肪組織無(wú)法剔除，腫塊周圍的脂肪組織也應(yīng)盡量剔除干凈。（3）切緣：應(yīng)根據(jù)臨床醫(yī)師標(biāo)記進(jìn)行取材，為防止標(biāo)本差錯(cuò)，用不同顏色的標(biāo)本托區(qū)分各方向切緣。

3.2速凍及包埋 速凍是影響冷凍切片質(zhì)量最關(guān)鍵的因素，組織若不是在最短時(shí)間內(nèi)冷凍，就易產(chǎn)生冰晶。冰晶就是緩慢冷凍使細(xì)胞內(nèi)的水分子向細(xì)胞間疏松區(qū)域游離、聚集，然后凝結(jié)成冰。冰晶會(huì)把組織或細(xì)胞間隙擴(kuò)大，等片子快速放入固定液后，冰融化成水，周圍組織收縮，引起組織結(jié)構(gòu)變形并留下了大量空洞。因此，只有快速冷凍，才能在細(xì)胞內(nèi)水分子還沒有游離出細(xì)胞前即凝結(jié)成冰，使胞漿內(nèi)的有形物質(zhì)基本上保持在原位[3]。標(biāo)本托上的包埋劑應(yīng)盡量少放，包埋劑太多會(huì)影響冷凍的速度，繼而產(chǎn)生冰晶。淋巴結(jié)及切緣組織過小或過薄時(shí)，可將包埋劑先滴加在標(biāo)本托上，制作一個(gè)冰托，再將組織放在上面進(jìn)行包埋。對(duì)于含脂肪組織較多的切緣組織，由于脂肪組織本身結(jié)構(gòu)的特殊性，其被疏松結(jié)締組織分割成脂肪小葉，脂肪小葉由大量群集的脂肪細(xì)胞構(gòu)成，脂肪細(xì)胞中含有大量脂滴，很難被凍硬，可將它們放在吸水紙間，用手指輕壓，把脂滴擠出后再進(jìn)行包埋。

圖1　乳腺癌，組織結(jié)構(gòu)清晰，核質(zhì)分明，染色鮮艷（HE，×100）

圖2　前哨淋巴結(jié)，組織結(jié)構(gòu)清晰，核質(zhì)分明，染色鮮艷（HE，×100）

3.3切片 腫塊切片時(shí)手搖輪用力應(yīng)均勻、柔和，盡量切取靠近凍錘表面的組織，切出最大面即可，因?yàn)樾薜迷缴?，里面的組織凍得越慢，易產(chǎn)生冰晶。淋巴結(jié)組織由于其細(xì)胞較豐富，纖維成分少，組織易發(fā)脆，切片時(shí)容易產(chǎn)生裂痕，切片溫度應(yīng)調(diào)節(jié)至－12℃左右，切片厚度4 m，若出現(xiàn)裂痕，可用拇指指腹輕按標(biāo)本使其復(fù)溫，淋巴結(jié)的被膜一定要切全，以免被膜下竇內(nèi)的微小轉(zhuǎn)移癌漏診。對(duì)于含較多脂肪組織的切緣，將箱體溫度調(diào)節(jié)至－35℃左右，切片厚度15～20 m，切片時(shí)應(yīng)快速進(jìn)刀，因?yàn)榈犊诘臏囟鹊陀诶鋬鼋M織的溫度，若勻速緩慢進(jìn)刀，會(huì)使切片上的脂肪組織變軟，使得切片粘連于刀口或自身粘連，不能平整展開而出現(xiàn)皺褶[4]。需指出的是切片時(shí)，觀察窗不可打開過大，其一防止溫度升高影響切片；其二防止散熱片及速凍臺(tái)產(chǎn)生更多的冰霜，影響冷凍系統(tǒng)的效率。

3.4固定 固定可有效抑制組織內(nèi)各種酶的活性，防止組織自溶和腐敗，保持組織與生活時(shí)相似的結(jié)構(gòu)和形態(tài)[5]。貼片完成后應(yīng)立即放入固定液中固定1 min，固定若不及時(shí)充分，會(huì)造成細(xì)胞核模糊不清，嚴(yán)重影響診斷質(zhì)量。固定液選擇甲醇，其固定時(shí)間快，細(xì)胞收縮小，對(duì)細(xì)胞核和抗原的保存較好[6]。

3.5染色及封片 入Baso蘇木精染液染色2 m in，水洗，溫水藍(lán)化，入Baso醇溶性伊紅染液染色2～3 s，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。若使用堿性液體藍(lán)化，水洗應(yīng)充分，否則會(huì)造成伊紅著色不均，同時(shí)二甲苯透明也應(yīng)充分，防止切片呈云霧狀。

綜上所述，保乳手術(shù)中需要做冷凍切片的標(biāo)本量大，時(shí)間緊，需要對(duì)標(biāo)本進(jìn)行科學(xué)的統(tǒng)籌管理，對(duì)各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行質(zhì)量控制，才能在最短的時(shí)間內(nèi)完成標(biāo)本的切片及染色，確保病理診斷的準(zhǔn)確與及時(shí)，為手術(shù)保駕護(hù)航。