HBsAg陽性肝癌患者ALK表達及預(yù)后影響因素分析

阮雅君，潘登，張雯靜，毛海香

肝癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率及死亡率較高的惡性腫瘤，慢性肝炎及肝硬化是其致病的主要因素。近年來，隨著醫(yī)學(xué)研究的不斷深入，肝癌的治療取得了較為顯著的成果，但患者治療后易復(fù)發(fā)，5年總生存率普遍較低，嚴重威脅我國居民的生命和健康。間變性淋巴瘤激酶（ALK）屬于胰島素受體酪氨酸激酶超家族，它的激活可影響患者腫瘤細胞的增殖分化與凋亡，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。迄今為止，ALK表達異常已在肺癌、乳腺癌及結(jié)腸癌中有較多的報道[1-2]，但肝癌中ALK表達的研究還比較少，因此，本研究回顧分析乙肝表面抗原（HBsAg）陽性肝癌患者ALK表達的情況及其預(yù)后影響因素，旨在為肝癌患者的治療提供理論參考依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料 收集 2010年 1月至2012年12月寧波市臨床病理診斷中心經(jīng)術(shù)后確診為HBsAg陽性的154例肝癌患者的腫瘤組織標本，所有病理標本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，并回顧性分析患者的臨床病理資料。其中男98例，女56例；年齡33～82歲，平均（57.65±19.40）歲。納入標準：（1）符合肝癌病理及組織學(xué)診斷標準；（2）經(jīng)血清學(xué)檢測為HBsAg陽性；（3）病理學(xué)標本及臨床資料完整。排除合并其他惡性腫瘤者及免疫系統(tǒng)疾病者。

1.2試劑與方法

1.2.1主要試劑 二甲苯（杭州雙林化工試劑有限公司，106-42-3），二氨基聯(lián)苯胺（DAB，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，PV6000），兔抗人ALK單克隆抗體（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，RAB-0086），II抗 SP免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，PV6000）等。

1.2.2方法 免疫組化方法：對腫瘤組織標本蠟塊進行4 m厚連續(xù)切片，將切片于二甲苯中進行3次脫蠟，5 m in/次，依次過100%、90%、70%梯度乙醇水化處理各2 min；切片浸入3%的過氧化氫去離子水中3m in，消除內(nèi)源性過氧化物酶，乙二胺四乙酸（EDTA、pH值8.0）修復(fù)液常規(guī)修復(fù)，以充分暴露抗原位點；自然冷卻后，室溫下加封閉液封閉15m in，兔抗人ALK單克隆抗體（1∶50）4℃孵育過夜；第2天，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗切片3次，5m in/次，然后加II抗孵育15m in，PBS漂洗 3 次，5 m in/次；加鏈霉卵白素孵育15min，PBS漂洗3次，5min/次；DAB顯色10 m in，終止顯色；蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇固定，封片膠封片；觀察腫瘤組織ALK陽性表達情況。ALK免疫組化陽性判定方法：ALK陽性表達表現(xiàn)為胞漿內(nèi)呈現(xiàn)棕褐色著色，按陽性細胞百分率判斷ALK表達情況，陽性細胞＜10%為ALK陰性表達，陽性細胞≥10%為ALK陽性表達。

1.3隨訪 將患者手術(shù)日期作為隨訪起始日期，患者死亡或2017年12月30日作為隨訪截止日期，觀察患者5年總生存率及5年總生存時間（OS）。

1.4統(tǒng)計方法 采用 SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用 檢驗；計數(shù)資料以率表示，采用2檢驗；預(yù)后影響因素采用Cox多因素分析＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.2影響患者預(yù)后的單因素分析 對可能影響患者5年總生存率的單因素進行分析，結(jié)果表明ALK表達情況、肝功能Child-Pugh分級、肝癌結(jié)節(jié)數(shù)、腫瘤直徑及術(shù)后輔助治療是影響患者5年總生存率的因素（均＜0.05）。見表1。

2.3Cox多因素回歸分析 以患者5年總生存率為因變量，以單因素分析中有統(tǒng)計學(xué)意義的因素為自變量，進行Cox多因素回歸分析，結(jié)果表明ALK表達情況、腫瘤直徑及術(shù)后輔助治療是影響患者5年總生存率的主要因素（均＜0.05）。見表 2。

3　討論

肝癌是肝膽外科常見疾病，其發(fā)生、發(fā)展與多種基因突變及新生血管增生異常等有關(guān)。盡管目前臨床對其治療的研究已取得較大進展，但其發(fā)病機制尚不完全清楚，患者總生存率提高甚微，因此加強肝癌病因?qū)W研究，探索肝癌分子靶向治療的潛在靶點至關(guān)重要。近年來，ALK抑制劑在 EML4-ALK陽性非小細胞肺癌（NSCLC）治療中的高有效率[3]，使ALK在腫瘤細胞中的表達成為臨床上研究的熱點。因此，本研究探討HBsAg陽性肝癌患者ALK的表達情況及預(yù)后影響因素，以期為肝癌個體化治療提供理論參考。

ALK蛋白位于細胞膜上，正常情況下，細胞外的內(nèi)源性配體肝素結(jié)合細胞因子（MK）和多效生長因子（PTN）將2個ALK蛋白偶聯(lián)，激活胞內(nèi)PI3K/AKT和MAPK通路，促進細胞生長。ALK蛋白主要在人體胚胎期表達，以促進神經(jīng)細胞增殖，當神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育完全后，進入休眠狀態(tài)，除神經(jīng)源性細胞外，人體其他細胞基本不表達ALK，如果ALK在錯誤的時間、部位表達，便會引發(fā)疾病[4]。本研究探討了ALK在HBsAg陽性肝癌組織中的表達情況，發(fā)現(xiàn)ALK蛋白陽性表達率為30.52%，提示ALK在HBsAg陽性肝癌患者腫瘤組織中表達升高，有望成為HBsAg陽性肝癌分子靶向治療的靶點及患者個體化治療的依據(jù)。

另外，本研究在分析影響患者預(yù)后的因素中發(fā)現(xiàn)，ALK表達情況、腫瘤直徑及術(shù)后輔助治療是影響患者5年總生存率的主要因素（均＜ 0.05）。劉建化等[5]在ALK蛋白與HBsAg陽性肝癌臨床病理相關(guān)性的研究中指出，患者ALK表達與腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)及微轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，提示ALK在肝癌的發(fā)生發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著非常重要的作用，可能是由于ALK陽性的肝癌組織具有更強的侵襲能力，導(dǎo)致患者預(yù)后較差。另外，隨著患者腫瘤直徑的增加，患者肝臟代償能力降低，考慮到肝切除術(shù)后殘余肝不能滿足生理功能的需要，患者常不能耐受根治性切除的范圍，導(dǎo)致腫瘤切除不完全或手術(shù)切緣與腫瘤距離過小，患者術(shù)后更易復(fù)發(fā)，且腫瘤直徑越大，腫瘤細胞向周邊轉(zhuǎn)移的機會越多，導(dǎo)致患者預(yù)后較差。肝癌具有起病隱匿及發(fā)展迅速等特點，一般發(fā)現(xiàn)時癌細胞已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，且外科手術(shù)在切除腫瘤病灶時，對腫瘤的推擠可能導(dǎo)致腫瘤組織和細胞脫落，并通過血液循環(huán)傳播至其他組織。因此，術(shù)后預(yù)防性行肝動脈化療栓塞術(shù)（TACE）有助于清除轉(zhuǎn)移或脫落的癌細胞，起到預(yù)防復(fù)發(fā)及延長生存期的作用[6]?；熓且环N全身治療的手段，給藥后，藥物會隨著血液循環(huán)遍布全身大部分器官和組織，殺傷轉(zhuǎn)移或脫落的癌細胞，提高患者預(yù)后。因此，術(shù)后可根據(jù)患者具體情況選擇相應(yīng)的輔助治療。

圖1　5年OS

表1　影響患者預(yù)后的單因素分析

表2　Cox多因素回歸分析

綜上所述，ALK表達上調(diào)可作為HBsAg陽性肝癌患者個體化治療的依據(jù)，患者預(yù)后受多種因素的影響，可根據(jù)患者術(shù)后情況選擇性行TACE或化療治療。

參考文獻：