不同游離脂肪酸通過PI3K/AKT途徑對(duì)INS-1細(xì)胞增殖與凋亡的影響

戴盈，崔巍，徐利，施秉銀，趙廷啟

在肥胖個(gè)體和2型糖尿?。═2DM）患者中常有體內(nèi)游離脂肪酸（FFA）的升高，研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)FA的升高可能與胰島 細(xì)胞功能障礙和T2DM的發(fā)病密切相關(guān)。FFA包括飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸，后者又分為單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸。目前關(guān)于不同F(xiàn)FA對(duì)胰島 細(xì)胞的生存與死亡的影響存在爭(zhēng)論，有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)以大鼠INS-1胰島 細(xì)胞瘤株（以下簡(jiǎn)稱INS-1細(xì)胞）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察不同濃度飽和脂肪酸（棕櫚酸，PA）、單不飽和脂肪酸（油酸，OA）和FFA加用廣譜Caspase抑制劑和PI3K抑制劑對(duì)體外培養(yǎng)下的INS-1細(xì)胞的增殖和凋亡的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1材料 INS-1細(xì)胞由中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所病理生理研究室婁晉寧教授和瑞士日內(nèi)瓦大學(xué)王海燕博士所贈(zèng)。PA、OA、四甲基偶氮唑鹽（MTT）及無FFA的牛血清白蛋白（BSA）均購自Sigma公司。RPM I1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國(guó)Invitrogen（GIBICO）公司。Annexin-Ⅴ/FITC試劑盒購自深圳晶美公司。Z-VAD-fmk購自 Alexis公司，LY294002購自CST公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) INS-1細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPM I1640培養(yǎng)基（11.1 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L的丙酮酸鈉，10 mmol/L的HEPES，2 mmol/L的L-谷氨酰胺，及55mol/L的 巰基乙醇）在37℃/5%CO2的細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)，待到細(xì)胞85%左右貼壁，棄去原有培養(yǎng)基，用無血清的含0.1%BSA和0.5mmol/L葡萄糖的RPM I1640培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行24h同步化培養(yǎng)。然后用不同濃度的PA和OA進(jìn)行干預(yù)。

1.2.2FFA的配制[1]用0.1mol/LNaOH溶液在70℃水浴中溶解一定量的OA和PA，振蕩混勻10 m in，然后過濾，配成100 mmol/L的OA/PA儲(chǔ)存液。在55℃水浴中用去離子水配5%BSA溶液，過濾。然后將上述的FFA溶液和BSA溶液按1∶19的體積比混合配成5mmol/LFFA/5%BSA復(fù)合液。復(fù)合液在水浴中振蕩10 s后繼續(xù)水浴10 m in，取出后冷卻至室溫，過濾。然后將上述復(fù)合液分別用無血清含葡萄糖16.7mmol/L的RPM I1640培養(yǎng)基以1∶5和1∶10的比例稀釋成1.0mmol/LFFA/1%BSA和0.5 mmol/L FFA/0.5%BSA的實(shí)驗(yàn)所需濃度；用無血清含葡萄糖5.5mmol/L的RPMI1640培養(yǎng)基以1∶10和1∶20的比例稀釋成0.5mmol/LFFA/0.5%BSA和0.25mmol/L FFA/0.25%BSA的實(shí)驗(yàn)所需濃度。

1.2.3MMT法測(cè)定細(xì)胞增殖情況 將INS-1細(xì)胞按每孔104種于96孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞85%貼壁，細(xì)胞同步化24h，棄去原有培養(yǎng)基，加入含不同濃度FFA的培養(yǎng)基干預(yù)。實(shí)驗(yàn)組分別是終濃度為0.25、0.5mmol/L OA；0.25、0.5mmol/LPA；0.5mmol/LOA/PA+100mol/L Z-VAD-fmk；以及 0.5 mmol/L OA/PA+20mol/L LY294002。同時(shí)設(shè)含0.25%BSA和0.5%BSA的兩組對(duì)照組。每組5個(gè)復(fù)孔，每孔總反應(yīng)體系為200l。按照設(shè)定的時(shí)間，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞并拍攝記錄細(xì)胞形態(tài)；然后每孔加入MTT 20l，繼續(xù)培養(yǎng) 4h。棄去上清液，每孔加入二甲基亞砜200l，振蕩10min，酶標(biāo)儀（德國(guó)BGM公司，型號(hào)：POLARstarOPTIMA）測(cè)定590nm下各個(gè)組實(shí)驗(yàn)對(duì)象的吸光度（A）。

1.2.4用Annexin-Ⅴ/FITC試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡將INS-1細(xì)胞按每孔106種于6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞85%貼壁，同步化培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)組分別用含0.5 mmol/L的OA/PA和1.0mmol/L的OA/PA的無血清高糖（含葡萄糖16.7mmol/L）RPM I1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，對(duì)照組用含0.5%或1%BSA的無血清高糖RPM I1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔。在6、16、24 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞并拍攝記錄細(xì)胞形態(tài)，然后分別消化細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，用4℃預(yù)冷的PBS緩沖液洗細(xì)胞兩次，然后用結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞的濃度為106/m l。每個(gè)樣本取100l的細(xì)胞懸液，加入5l的Annexin-Ⅴ/FITC和10l的碘化丙啶（PI，20g/ml）溶液，混勻后室溫避光孵育15 min，在每個(gè)樣本中加入400l結(jié)合緩沖液，流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司，型號(hào)：FACSCalibur）測(cè)量并分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用方差分析，兩兩比較采用LSD-檢驗(yàn)。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1不同濃度的OA和PA對(duì)INS-1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 與對(duì)照組相比，在各時(shí)間點(diǎn)，兩種濃度OA對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)均具有促進(jìn)作用（均＜ 0.05），以 0.25mmol/L OA促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)作用更為明顯，細(xì)胞增殖程度分別是對(duì)照組的1.3倍、1.5倍和1.9倍；而0.25 mmol/L PA和0.50 mmol/L PA均能抑制細(xì)胞生長(zhǎng)（均＜0.05），以0.50mmol/LPA的抑制作用更為明顯，其作用下的細(xì)胞增殖程度僅為對(duì)照組的42%、45%和32%。各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞在48h生長(zhǎng)程度達(dá)到最大。見表1。

表1　不同濃度的油酸和棕櫚酸對(duì)INS-1細(xì)胞增殖（吸光度A）的影響

2.2不同Caspase抑制劑對(duì)INS-1細(xì)胞增殖的影響在含0.5 mmol/L OA/PA的高糖培養(yǎng)基中加入Caspase抑制劑Z-VAD-fmk（以下簡(jiǎn)稱VAD），并使其終濃度為100mol/L，培養(yǎng)細(xì)胞28 h后，OA干預(yù)下的兩組細(xì)胞增殖程度均高于對(duì)照組，其中，VAD組的細(xì)胞增殖程度稍低于無VAD組的細(xì)胞，無VAD組的細(xì)胞增殖程度與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜ 0.05）；PA干預(yù)的兩組細(xì)胞增殖程度均低于對(duì)照組，但VAD組的細(xì)胞增殖程度要高于無VAD組的細(xì)胞，而無VAD組的細(xì)胞與對(duì)照組相比增殖明顯受到抑制（＜0.01）。見表2。

表2　廣譜Caspase抑制劑VAD處理后的Ins-1細(xì)胞增殖情況

同樣在含0.5 mmol/L OA/PA的高糖培養(yǎng)基中加入終濃度為20mol/L的PI3K抑制劑LY294002（以下簡(jiǎn)稱LY），培養(yǎng)細(xì)胞30 h后，MTT法觀察發(fā)現(xiàn)，在OA和PA兩種干預(yù)下，加LY組處理的細(xì)胞增殖程度均明顯低于相應(yīng)的不加LY組的細(xì)胞（＜0.01）。與對(duì)照組相比，OA能顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖（＜0.01），OA+LY、PA、PA+LY這3組的細(xì)胞增殖均明顯受到抑制（均＜0.01）。OA+LY組細(xì)胞增殖程度明顯高于PA+LY組細(xì)胞。見表3。

表3　PI3K抑制劑LY處理后對(duì)Ins-1細(xì)胞增殖的影響

2.3不同濃度OA和PA對(duì)INS-1細(xì)胞凋亡的影響用不同濃度的OA和PA作用，在各時(shí)間段均可見到凋亡細(xì)胞。隨著時(shí)間的推移，各實(shí)驗(yàn)組的凋亡細(xì)胞量增多，尤其在24h后，倒置顯微鏡下可見到大量細(xì)胞凋亡：細(xì)胞皺縮成圓形或橢圓形，失去原有的突觸，漂浮或懸浮于培養(yǎng)基中，不再貼壁生長(zhǎng)（封二彩圖3A、B、C）。而較對(duì)照組而言，OA組的細(xì)胞凋亡量要少于對(duì)照組（封二彩圖3B），而PA組的細(xì)胞凋亡量要明顯多于對(duì)照組（封二彩圖3C）。

用Annexin-Ⅴ/FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)可測(cè)知各個(gè)時(shí)間段各組細(xì)胞凋亡的比例。在6 h，OA組和PA組作用下細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)（均＞0.05），但1 mmol/L OA細(xì)胞凋亡比例明顯少于同濃度PA組（＜0.01）。24 h高濃度OA引起細(xì)胞凋亡與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）；0.50 mmol/L和1 mmol/L PA組的細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均＜ 0.05）。對(duì)照組及PA組細(xì)胞的凋亡均隨著時(shí)間的推移逐漸增加（＜0.05）；而OA組引起的細(xì)胞凋亡在各個(gè)時(shí)間段差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均＞0.05）。見表4。

3　討論

本研究顯示，不飽和脂肪酸OA可促進(jìn)細(xì)胞增殖，而飽和脂肪酸PA則抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。OA組細(xì)胞在48h增殖程度達(dá)到最大，48h后，生長(zhǎng)程度逐漸下降，可能是測(cè)定細(xì)胞增殖是在無血清、低糖（葡萄糖濃度為5.5mmol/L）培養(yǎng)基中進(jìn)行，而48 h后無血清、低糖條件下氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡超過OA促增殖作用，以致72 h細(xì)胞增殖程度低于48 h，盡管如此，72 h的OA和PA相比還是顯示出較少的細(xì)胞毒性。

表4　不同濃度OA和PA作用下對(duì)INS-1細(xì)胞凋亡的影響

研究證明，Caspase家族在細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)過程中起到核心作用，VAD是廣譜的Caspase抑制劑，可抑制由Caspase所引起的細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)在OA組應(yīng)用了VAD之后，并沒有使細(xì)胞生長(zhǎng)率顯著提高，可能是OA本身能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，故VAD對(duì)OA組細(xì)胞生長(zhǎng)的影響不大。而PA組應(yīng)用了VAD之后，細(xì)胞生長(zhǎng)率有所增加，提示PA引起的INS-1細(xì)胞凋亡的信號(hào)途徑中有Caspase參與其中。PI3K/Akt信號(hào)通路中的下游反應(yīng)元件cIAP-2和XIAP是Caspase有效的抑制劑，可阻斷細(xì)胞的凋亡反應(yīng)[7]。本研究中，應(yīng)用了LY的OA組和PA組，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受抑，提示LY作為PI3K抑制劑，通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路使Caspase失去抑制，致細(xì)胞凋亡增加。上述結(jié)果提示，PI3K/Akt信號(hào)通路在INS-1細(xì)胞脂性凋亡中對(duì)維持應(yīng)激細(xì)胞的生存具有重要意義，而PA引起的細(xì)胞凋亡是通過Caspase介導(dǎo)的。

本研究對(duì)細(xì)胞凋亡的測(cè)定是在高糖（16.7mmol/L）及無血清條件下進(jìn)行的。結(jié)果顯示，PA使細(xì)胞凋亡顯著增加；而OA作用下細(xì)胞凋亡率低于對(duì)照組和PA組。本實(shí)驗(yàn)對(duì)照組引起細(xì)胞大量凋亡的原因可能與高糖、無血清環(huán)境所致高糖毒性及氧化應(yīng)激有關(guān)。由此，筆者推測(cè)，OA在促進(jìn)細(xì)胞增殖同時(shí)，還能對(duì)抗高糖毒性誘發(fā)的 細(xì)胞凋亡，對(duì) 細(xì)胞起到保護(hù)作用。

總之，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了OA能促進(jìn)INS-1細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制其凋亡，對(duì) 細(xì)胞具有保護(hù)作用；PA則抑制INS-1細(xì)胞的生長(zhǎng)，并促進(jìn)其凋亡，對(duì) 細(xì)胞具有毒性作用。通過應(yīng)用廣譜Caspase抑制劑VAD和PI3K抑制劑LY對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響的研究，發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號(hào)通路在胰島 細(xì)胞脂性凋亡中對(duì)維持應(yīng)激細(xì)胞的生存具有重要意義；在高濃度PA長(zhǎng)期作用下引起的INS-1細(xì)胞凋亡是通過Caspase介導(dǎo)的。而上述結(jié)論中涉及的具體分子機(jī)制，還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

參考文獻(xiàn)：