糖尿病腎病患者線粒體結(jié)構(gòu)變化對(duì)腎小管病理?yè)p傷的影響分析

詹明，張國(guó)陽(yáng)，楊軍，余晶波

糖尿病腎病（DN）是引起終末期腎臟?。‥SRD）的主要原因，大致占ESRD患者的40%～50%[1]。由于DN發(fā)病原因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，臨床治療措施有限，故其發(fā)病機(jī)制的研究一直是國(guó)內(nèi)外腎臟病領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，DN腎小管病變并不繼發(fā)于腎小球，而是其早期和原始特征改變。相當(dāng)部分糖尿病患者存在腎小管和間質(zhì)細(xì)胞的病理萎縮，而腎小球正常[2]。因此，腎小管細(xì)胞損傷是DN發(fā)病過(guò)程中的一個(gè)核心環(huán)節(jié)。

最新的研究表明，線粒體不僅是細(xì)胞內(nèi)能量工廠，也是高度動(dòng)態(tài)的細(xì)胞器，處于不斷的融合和分裂中[3]。在糖尿病高糖狀態(tài)下，在細(xì)胞和動(dòng)物研究中表明腎小管細(xì)胞中的線粒體發(fā)生一系列形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的病理變化，這些變化與腎小管細(xì)胞線粒體自噬和氧化應(yīng)激反應(yīng)等密切相關(guān)，在細(xì)胞氧化損傷與細(xì)胞凋亡等過(guò)程中起著重要作用[4]。然而，有關(guān)腎臟細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)變化在臨床上對(duì)DN患者發(fā)病過(guò)程中起的作用，尤其是對(duì)腎小管損傷的影響和相關(guān)性研究，文獻(xiàn)報(bào)道十分有限。因此，本研究針對(duì)DN患者，在臨床上觀察線粒體結(jié)構(gòu)變化和對(duì)腎小管病理改變的影響和作用，以進(jìn)一步揭示DN的發(fā)病機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料 收集寧波市第一醫(yī)院腎臟病理標(biāo)本庫(kù)中篩選2014年1月至2016年12月的DN患者并行腎活檢確診的病例共20例（DN組），同時(shí)收集微小病變患者并行腎活檢確診的病例共20例作為對(duì)照組。

1.2實(shí)驗(yàn)方法 收集兩組腎活檢組織標(biāo)本行進(jìn)一步病理檢查，通過(guò)常規(guī)組化染色以觀察腎臟病理改變，并比較兩組腎臟損傷等級(jí)評(píng)分。通過(guò)透射電鏡觀察和比較腎小管細(xì)胞中線粒體的形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步分析DN組腎小管細(xì)胞中線粒體結(jié)構(gòu)變化和腎小管損傷的相關(guān)性。

將腎活檢組織以4%多聚甲醛固定，經(jīng)乙醇脫水，石蠟包埋，石蠟組織切片及HE、PAS等常規(guī)組化染色后，在光鏡下行石蠟切片檢查。用于電鏡的組織標(biāo)本以2.5%戊二醛固定，經(jīng)脫水、包埋、超薄切片及染色等制備電鏡標(biāo)本供透射電鏡檢查。腎臟損傷等級(jí)評(píng)分采用0～3分的腎臟形態(tài)損傷評(píng)分系統(tǒng)：沒(méi)有腎小球/腎小管損傷為0分；25%的腎小球/腎小管損傷為1分；25%～50%的腎小球/腎小管受累為2分；50%及以上的腎小球/腎小管面積受累為3分。

腎活檢組織中腎小管細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察方法采用固定后的腎組織塊常規(guī)樣品制備，超薄切片鉛鈾雙染，透射電鏡下觀察。選取含線粒體豐富的腎小管上皮細(xì)胞，主要觀察線粒體融合/分裂的結(jié)構(gòu)變化，線粒體肌絲、肌原纖維、體積和嵴密度及線粒體嵴的超微形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，并統(tǒng)計(jì)發(fā)生上述線粒體結(jié)構(gòu)變化的腎小管細(xì)胞百分比。

1.3統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用 檢驗(yàn)；采用Pearson分析進(jìn)行相關(guān)性分析。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1兩組腎臟損傷比較 兩組腎小球和腎小管的損傷評(píng)分差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均＜ 0.05）。見(jiàn)表 1。

2.2腎小管細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察 對(duì)照組微小病變患者腎小管的線粒體呈正常的圓柱狀形態(tài)，線粒體外膜和內(nèi)膜結(jié)構(gòu)清晰，嵴分布均勻。其中含正常結(jié)構(gòu)線粒體的腎小管細(xì)胞占（80±5）%。而DN組的腎小管細(xì)胞中線粒體較對(duì)照組出現(xiàn)片段化改變，其中（60±12）%的腎小管細(xì)胞出現(xiàn)線粒體的超微結(jié)構(gòu)異常變化，表現(xiàn)為線粒體片段化和圓柱狀結(jié)構(gòu)斷裂，呈小橢圓形散在分布，質(zhì)量和體積減少，線粒體基質(zhì)破壞且出現(xiàn)線粒體嵴溶解和嵴重構(gòu)。

2.3線粒體結(jié)構(gòu)改變和腎小管病理?yè)p傷的相關(guān)性分析 進(jìn)一步將DN組腎組織樣本中發(fā)生線粒體超微結(jié)構(gòu)變化的腎小管細(xì)胞百分比和腎小管病理?yè)p傷評(píng)分這兩個(gè)重要參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示發(fā)生線粒體結(jié)構(gòu)變化的細(xì)胞百分比與腎小管損傷評(píng)分呈正相關(guān)（=0.816＜ 0.05）。

3　討論

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為DN主要是腎小球病變，而腎小管的病變較輕微且非特異性。近期的研究發(fā)現(xiàn)，腎小管病變也是DN的特征性病理改變，并非繼發(fā)于腎小球，且是預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展和預(yù)后的重要指標(biāo)。臨床觀察證明，51%的I型糖尿病患者存在腎小管細(xì)胞萎縮[5]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)：在DN的病理改變中，大約1/3的患者無(wú)腎小球病變，表現(xiàn)為明顯的腎小管細(xì)胞和腎間質(zhì)損害；1/3的患者為腎小球病變；其它1/3的患者則無(wú)腎臟結(jié)構(gòu)變化[6-7]。因此，腎小管損傷的研究是闡明DN發(fā)病機(jī)制的重要研究方向。本研究證實(shí)了DN患者的腎組織中腎小球和腎小管均出現(xiàn)了特征性的病理?yè)p傷，且損傷評(píng)分與對(duì)照組微小病變患者比較差異顯著，提示腎小管損傷在DN發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用。

目前，糖尿病患者發(fā)生腎小管病理?yè)p傷的病因和機(jī)制仍不清楚。腎小管上皮細(xì)胞在腎臟的重吸收和調(diào)節(jié)尿液過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，需消耗大量的ATP酶，為此腎小管富含大量亞細(xì)胞器即線粒體以不斷供給能量。因而，從線粒體著手是研究腎小管損傷機(jī)制的重要途徑[8-9]。本研究進(jìn)一步通過(guò)電鏡觀察發(fā)現(xiàn)DN患者的腎小管細(xì)胞線粒體發(fā)生了顯著性結(jié)構(gòu)變化，包括出現(xiàn)線粒體斷裂和片段化，線粒體質(zhì)量和體積減少，線粒體嵴腫脹并伴有嵴溶解等特征性的超微結(jié)構(gòu)變化。且定量分析顯示DN組中含異常結(jié)構(gòu)線粒體的腎小管細(xì)胞數(shù)量是對(duì)照組的3倍。此外，本研究的相關(guān)性分析顯示含異常結(jié)構(gòu)線粒體的腎小管細(xì)胞百分比與腎小管損傷評(píng)分呈正相關(guān)，提示糖尿病環(huán)境下線粒體超微結(jié)構(gòu)變化是 DN腎小管病變的一個(gè)重要致病因素。結(jié)果分析其主要致病原因在于，線粒體的結(jié)構(gòu)決定功能，在糖尿病高糖作用下，腎小管中的線粒體動(dòng)力學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生異常，引起線粒體氧化磷酸化功能障礙，釋放過(guò)量的活性氧簇，并激活了線粒體凋亡途徑，從而引起腎小管細(xì)胞氧化損傷和凋亡。因此，在病理上表現(xiàn)為腎小管的萎縮等病變。

表1　兩組腎臟損傷評(píng)分比較 分

本研究揭示了腎小管細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)變化在DN發(fā)病過(guò)程中的關(guān)鍵作用，為糖尿病腎小管損傷的發(fā)病機(jī)制提供了新的臨床和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。這一問(wèn)題的闡明對(duì)DN的發(fā)病機(jī)制和靶向治療的研究具有重要的臨床意義，將為今后開(kāi)發(fā)以線粒體為靶向藥物干預(yù)治療來(lái)防治DN開(kāi)辟新的理論和分子“靶點(diǎn)”，為最終有效治療DN這一日益增長(zhǎng)且嚴(yán)重危害人們健康的疾病提供新的思路和策略。