一株耐鹽溶磷真菌的篩選、鑒定及其生物肥料的應(yīng)用效果

江紅梅，殷中偉，史發(fā)超，劉彩月，程明芳，范丙全

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081）

土壤缺磷是限制作物產(chǎn)量的一個(gè)重要因素，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界約有57萬公頃的耕地缺磷[1]，而我國約有2/3的耕地磷素缺乏尤為突出[2]。長期以來，施用磷肥是糧食增產(chǎn)的重要舉措。大量研究顯示，施入土壤的磷肥當(dāng)季利用率不超過20%[3]，其中絕大部分磷與土壤中Ca2+、Fe3+、Fe2+、Al3+等離子結(jié)合轉(zhuǎn)化為難溶磷，不易被植物吸收利用[1]。迄今，世界各國依靠大量消費(fèi)磷肥確保作物增產(chǎn)，保障糧食安全，從而導(dǎo)致磷礦資源的消費(fèi)量逐年增加。我國90%以上磷礦為中低品位，按現(xiàn)有的年消費(fèi)量，我國磷礦使用年限將不足20年[3]。因此，提高磷肥及磷礦資源的利用效率和土壤磷庫的有效性，延長磷礦資源的使用期限，對世界各國農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義[4–5]。

溶磷微生物能活化土壤難溶磷、提高磷肥利用率、增加作物吸磷量、促進(jìn)作物增產(chǎn)[4–6]，其生物肥料制劑已經(jīng)成為一種高效、經(jīng)濟(jì)、環(huán)境友好的轉(zhuǎn)化土壤難溶磷的生物措施。溶磷微生物依靠自身產(chǎn)生有機(jī)酸[7–8]、分泌H+離子[9]，將難溶磷轉(zhuǎn)化為有效磷，同時(shí)通過自身產(chǎn)生植物促生物質(zhì)[10]，在磷素的生物有效性和作物增產(chǎn)中發(fā)揮重要作用。自1903年Staltrom[10]從土壤中成功分離到溶磷細(xì)菌以來，溶磷微生物一直是研究熱點(diǎn)，國內(nèi)外相繼開展了溶磷微生物的大量篩選工作[12–13]，以期通過接種溶磷微生物制劑提高土壤難溶磷的有效性和磷肥利用率，從而減少磷礦資源的消費(fèi)量[7,14]。已有的報(bào)道表明，真菌的溶磷能力大于細(xì)菌，且溶磷性能穩(wěn)定[11]。

世界各國科學(xué)家分離了大量溶磷真菌，其種類主要是青霉菌[6]、曲霉菌[8]、木霉菌[15]、酵母菌[16]、籃狀菌[17]、正青霉菌[18]、根霉菌[19]、鐮刀菌[20]、小菌核菌[21]和輪枝菌[22]等，其中絕大部分為青霉菌和曲霉菌。溶磷青霉菌是一類重要的溶磷微生物資源，現(xiàn)已報(bào)道的溶磷青霉菌有微白青霉[23]、產(chǎn)黃青霉[24]、桔青霉[25]、?，F(xiàn)青霉[23]、微紫青霉[26]、梅利尼青霉[25]、黑青霉[27]、特異青霉[28]、橄欖色青霉[23]、島青霉[23]、草酸青霉[13]、產(chǎn)紫青霉[26]、局限青霉[23]、紅色青霉[26]、皺褶青霉[27]、托姆青霉[28]、斜臥青霉[29]、指狀青霉[30]、變換青霉[30]、繩狀青霉[32]、拜萊青霉[32]、紫棕青霉 (P. cf. fuscum)[33]、嗜松青霉[34]、淡紫青霉[35]、黃灰青霉[9]和棘孢青霉[36]，達(dá)26種之多。

絕大多數(shù)溶磷菌株是從作物根際土壤中分離，而一些溶磷菌株則是從特殊環(huán)境中獲得，以期更好地利用該類菌株具有溶磷功能和兼具適應(yīng)土著環(huán)境的特性。Chatli等[36]從低溫沙漠地區(qū)分離了溶磷青霉菌株FC28、FC39，對磷酸三鈣的溶解量分別為136.9 mg/L和103.3 mg/L；Bhattacharya等[37]從蚯蚓糞便中分離到溶磷菌株V1，對磷礦粉最大溶解率為36%，土壤有效磷含量提高13.65 mg/kg；Naveenkumar等[38]從檳榔殼廢棄物中獲得了溶磷菌Strain-1，對磷酸三鈣的溶解量為200 mg/L；Rinu等[39]從海拔1800～3610 m的喜馬拉雅山脈土壤中分離到溶磷菌株ITCC2546、ITCC4210和ARIFCC771，在盆栽實(shí)驗(yàn)中使玉米種子干重分別增加10.71%、33.33%和21.43%，小麥種子干重分別增加33.33%、37.04%和25.92%；李海云等[40]從豬糞堆肥中篩選到溶磷產(chǎn)黃青霉菌株P(guān)SM-1，對磷酸三鈣的溶解量為138.36 mg/L；Nath等[41]從茶樹葉中分離出溶磷菌Penicillium sp.1和Penicillium sp. 2，對磷酸三鈣的溶解量分別為86.10 mg/L和84.25 mg/L；Chai等[42]從明礬礦石中篩選到溶磷青霉菌株P(guān)SM11-5，對磷礦粉的溶解率達(dá)74.5%，且耐受重金屬Cd2+、Co2+和Cr6+的能力較好。

我國鹽堿地耕地面積約有1300萬公頃，是我國最具增產(chǎn)潛力的低產(chǎn)農(nóng)田。鹽堿土壤主要面對鹽堿脅迫和養(yǎng)分吸收兩大障礙[16]，鑒于目前鹽堿土壤治理采用的管道排鹽[44]、抗 (耐) 鹽育種[17]收效甚微，功能微生物及其制劑的應(yīng)用正在展現(xiàn)巨大潛能[44]。無論鹽分脅迫土壤，還是非鹽分脅迫的土壤，有效磷含量低是制約作物產(chǎn)量的主要因素之一[13]。因此，溶磷微生物，尤其耐鹽溶磷微生物受到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的高度重視[17]。國內(nèi)外已有少量耐鹽溶磷菌株的研究報(bào)道，其中，耐鹽溶磷青霉菌主要有菌株P(guān)SF2[44]、菌株P(guān)SFWRB-2[45]和菌株QL1501[46]。此外，紅酵母菌(Rhodotorula sp.) PS4[16]、木霉菌TRC3[15]和疣孢藍(lán)狀菌 (Talaromyces verruculosus) P10[17]等溶磷菌株的耐鹽能力較突出。本研究旨在篩選具有耐鹽能力的高效溶磷真菌，并對菌株的溶磷能力、代謝產(chǎn)物及促生增產(chǎn)效果進(jìn)行研究，為開發(fā)適用于鹽堿農(nóng)田土壤的溶磷生物肥料提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 土壤來源 從內(nèi)蒙古五原縣 (東經(jīng) 107°35′70″～108°37′50″，北緯 40°46′30″～41°16′45″) 輕中度鹽堿農(nóng)田采集向日葵根圍土壤樣品150個(gè)，土壤pH值為8.67，電導(dǎo)率EC為0.96 ms/cm。盆栽土壤來自北京市石灰性潮土、安徽省阜陽黏性潮土、安徽水稻土和山東沿海鹽潮土。土壤理化性狀見表1。

1.1.2 草炭 本研究菌劑使用的載體為草炭，該草炭產(chǎn)自我國東北地區(qū)，有效磷97.14 mg/kg、速效鉀48.36 mg/kg、有機(jī)質(zhì)219.74 g/kg。

1.1.3 培養(yǎng)基 1) 菌株篩選與培養(yǎng)：無機(jī)磷培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基等[4]。

2) Pikovskaya改良培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖 10.0g、(NH4)2SO40.5 g、酵母抽提物 0.5 g、KCl 0.2 g、FeSO4·7H2O 0.001 g、MnSO4·4H2O 0.001 g、Ca3(PO4)25.0 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、pH 7.0[47]。

表 1 供試土壤理化性狀Table 1 The physico-chemical properties of test soils

3) PDY培養(yǎng)基：土豆200 g與1 L蒸餾水混合煮沸20 min過濾，濾液補(bǔ)水至1 L，加入蔗糖10 g、酵母粉1 g。

4) PDA培養(yǎng)基：PDY加瓊脂18 g/L。

5) 耐鹽培養(yǎng)基：PDA加NaCl。分別配制NaCl含量為0%、5%、7.5%、10%和12.5%的培養(yǎng)基。

以上培養(yǎng)基滅菌條件均為121℃，20 min。1.1.4 供試磷源

1) 分析純磷酸三鈣[Ca3(PO4)2(P 20%)]、分析純磷酸鋁[AlPO4(P 25.41%)]，購于天津科密歐試劑公司。

2) 磷礦粉：貴州開陽磷礦粉 (Kaiyang rock phosphate，Kaiyang RP，P 14.79%)；江蘇錦屏磷礦粉 (Jinping rock phosphate，JPRP，P 15.01%)；云南晉寧磷礦粉 (Jinning rock phosphate，JNRP，P 14.75%)；河北釩山磷礦粉 (Fanshan rock phosphate，F(xiàn)SRP，P 14.80%) ；云南昆陽磷礦粉 (Kunyang rock phosphate，Kunyang RP，P 14.90%)。磷礦石均粉碎過100目 (149 μm) 篩，鉬銻抗比色法測定有效磷含量。

1.1.5 液質(zhì)聯(lián)用 (Liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS) 試劑

1) 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品 酒石酸 (DL-Tartaric acid)、草酸 (Oxalic acid) 、檸檬酸 (Citric acid)、蘋果酸 (DLMalic acid)、乳酸 (L(+)-Lactic acid)、琥珀酸(Succinic acid) 和延胡索酸 (Fumaric acid)，購自德國Dr. Ehrenstorfer公司。

2) 植物激素標(biāo)準(zhǔn)品 生長素 (IAA)、玉米素(Zeatin)，購于德國Dr. Ehrenstorfer公司。磷酸二氫鉀和磷酸為國產(chǎn)優(yōu)級純，甲酸銨、丙酸和甲醇(Methyl alcohol) 為色譜純 (美國Tedia公司)。試驗(yàn)用水為超純水 (電阻率為18.20 MΩ.cm)。

1.1.6 Hoagland 培養(yǎng)液配方 (mol/L) K2SO48 × 10–4、MgSO46.5 × 10–4、KCl 1 × 10–4、Ca(NO3)22 × 10–3、CuSO41 × 10–7、MnSO41 × 10–6、EDTA-Fe 1 × 10–7、H3BO31 × 10–5、ZnSO41 × 10–6、(NH4)6Mo7O245 ×10–9。用 0.01 mol/L NaOH 溶液和 0.01 mol/L HNO3溶液調(diào)節(jié)pH至5.8[48]。

1.1.7 供試菌株 草酸青霉 (Penicillium oxalicum) 菌株M2為本試驗(yàn)篩選菌株；斜臥青霉 (Penicillium decumbens) 菌株P(guān)83為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株。斜臥青霉P83和拜萊青霉ATCC20851作為對照菌株。

1.1.8 主要的試劑和儀器 真菌總DNA提取試劑盒、Taq酶和dNTP購自天根生化科技有限公司，其他試劑為國產(chǎn)分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') 和ITS4 (5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3')[49]；pH計(jì)為Mettler Toledo S40 seven multi；電導(dǎo)儀為Mettler Toledo FEP30；培養(yǎng)箱為DHP-9162型，購自上海一恒科技有限公司；PCR儀為GeneAmp PCR System 9700；高速離心機(jī)為Heraeus公司的Sorvall Biofuge Stratos；光學(xué)顯微鏡為OLYMPUS BH-2；掃描電子顯微鏡為FEI-QUANTA200；紫外分光光度儀為天美科技有限公司UV-7501。三重串聯(lián)四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀器 (美國Agilent)：主機(jī)Agilent LC 1290 Infinity2，Agilent QQQ 6470；工作站Agilent Masshunter。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶磷菌株的分離鑒定 采用梯度稀釋法獲得系列稀釋倍數(shù)的土壤菌懸液。稱取1g保藏于4℃冰箱的新鮮土壤，用0.85%滅菌的生理鹽水將土壤樣品稀釋至10–2～10–5倍，分別吸取0.1 mL土壤懸液涂布于無機(jī)磷培養(yǎng)基平板上，每個(gè)濃度土壤懸液重復(fù)涂布3個(gè)平板。置于培養(yǎng)箱中28℃倒置培養(yǎng)，選擇溶磷圈較大的菌株，轉(zhuǎn)接到PDA固體培養(yǎng)基平板上，純化后接入PDA斜面保藏。1.2.2 懸浮培養(yǎng)試驗(yàn) 將100 mL含5 g/L難溶磷的Pikovskaya培養(yǎng)液盛入三角瓶中，難溶磷磷源分別為磷酸三鈣、磷酸鋁、開陽磷礦粉 (Kaiyang RP)、錦屏磷礦粉 (JPRP)、晉寧磷礦粉 (JNRP)、釩山磷礦粉(FSRP) 和昆陽磷礦粉 (Kunyang RP)。于121℃滅菌30 min，接種1 mL溶磷菌懸液于無菌培養(yǎng)基中。試驗(yàn)處理包括：1) 對照 (CK)，接入1 mL滅菌培養(yǎng)液； 2) 黑曲霉菌P83；3) 草酸青霉菌M2。每個(gè)處理3次重復(fù)。置于28℃、160 r/min搖床培養(yǎng)，分別于3、6和9 d，取菌液5 mL，12000 r/min、4℃離心5 min，取上清液測定有效磷含量。

1.2.3 供試菌株在磷酸三鈣、磷酸鋁和磷礦粉溶磷過程中的pH值變化 試驗(yàn)設(shè)置同1.2.2的方法，分別測定在磷酸三鈣、磷酸鋁和5種磷礦粉中接種菌株M2、P83時(shí)，溶液pH值的變化。

1.2.4 供試菌株耐鹽性測定 用無菌接種環(huán)從長滿菌絲體的PDA培養(yǎng)液中，挑取一個(gè)較大的小球體接入固體耐鹽培養(yǎng)基中央，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中，從第3 d開始每日觀察并記錄菌絲在NaCl含量分別為0%、5%、7.5%、10%和12.5%的PDA平板中的生長狀況。

1.2.5 溶磷菌劑的制備 將50 g草炭置于500 mL三角瓶中，121℃間歇式滅菌3次，每次30 min。供試溶磷菌株M2、P83分別接種于PDA固體平板上，28℃倒置培養(yǎng)5 d，用接種環(huán)輕輕刮取孢子到50 mL滅菌PDB培養(yǎng)液中。在顯微計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，用培養(yǎng)液平衡至孢子數(shù)量約為1 × 108cfu/mL時(shí)，供試菌株的菌液與滅菌草炭以1∶1 (v/w) 混合均勻，28℃恒溫箱中培養(yǎng)1周備用。

1.2.6 液質(zhì)聯(lián)用 (LC-MS) 測定草酸青霉菌M2溶磷過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸 在200 mL三角瓶中裝入100 mL的Pikovskaya液體培養(yǎng)基，磷源分別為磷酸三鈣、磷酸鋁和昆陽磷礦粉三種。滅菌后接種1 mL 106cfu溶磷真菌M2的孢子懸液，在28℃，170 r/min搖床振蕩培養(yǎng)6 d。將菌液12000 r/min離心2 min取上清，加入2滴0.05%百里酚以抑制微生物活動(dòng)并防止有機(jī)酸分解。將菌液過水相0.22 μm濾膜后上機(jī)測試。

有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)液配制：分別精確稱取酒石酸(Tartaric acid)、草酸 (Oxalic acid)、蘋果酸 (Malic acid)、檸檬酸 (Citric acid)、乳酸 (Lactic acid)、延胡索酸 (Fumaric acid) 和琥珀酸 (Succinic acid)7種有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)品 (精確至0.0001 g)，用流動(dòng)相A溶解稀釋，用孔徑0.22 μm的微孔濾膜過濾，定容于50 mL容量瓶中，配制質(zhì)量濃度為100 mg/L的儲備液，4℃冷藏。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：根據(jù)文獻(xiàn)[12]及實(shí)際操作中紫外吸收靈敏度，將草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、延胡索酸、琥珀酸按照2.5∶5∶5∶5∶5∶0.5∶15的比例配制混標(biāo)，逐級稀釋成5、10、20倍分別為a、b、c和d級別的標(biāo)準(zhǔn)液，現(xiàn)配現(xiàn)用。其中a級別標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為56、120、140、103、150、10.8和 300 mg/L。

1) 高效液相條件 流動(dòng)相A配制：精準(zhǔn)稱量KH2PO4(精確至0.000 1 g)，用超純水溶解配制濃度為0.01 mol/L，加入適量H3PO4調(diào)節(jié)pH值至2.73，經(jīng)水系孔徑為0.22 μm的微孔濾膜過濾，超聲脫氣后備用。流動(dòng)相B為0.1%丙酸水∶甲醇 = 80∶20，經(jīng)超聲脫氣后備用。色譜柱為ZORBAX SB C18 (5 μm，250 mm × 4.6 mm)，流速為 0.5 mL/min，柱溫為25℃，進(jìn)樣量10 μL，運(yùn)行時(shí)間10 min。

2) 質(zhì)譜條件 負(fù)離子掃描，SIM模式，干燥氣溫度300℃，鞘氣溫度250℃，毛細(xì)管電壓3500 V，噴嘴電壓500 V。

1.2.7 液質(zhì)聯(lián)用 (LC-MS) 測定草酸青霉菌M2溶磷過程中分泌的植物激素 試驗(yàn)設(shè)計(jì)同1.2.6的方法。

植物激素標(biāo)準(zhǔn)液配制：分別精確稱取生長素(IAA) 和玉米素 (Zeatin) 標(biāo)準(zhǔn)品 (精確至 0.0001 g)，以甲醇溶解稀釋，用孔徑0.22 μm的微孔濾膜過濾，定容于50 mL容量瓶中，配制質(zhì)量濃度為100 mg/L的儲備液，4℃冷藏。

1) 高效液相條件 流動(dòng)相為5 mmol/L甲酸銨水∶甲醇 = 70∶30。色譜柱為Eclipse XDB C18(3.5 μm，2.1 mm × 150 mm)，流速為 0.3 mL/min，柱溫為25℃，進(jìn)樣量10 μL，運(yùn)行時(shí)間6 min。

2) 質(zhì)譜條件 正離子掃描，MRM模式，干燥氣溫度300℃，鞘氣溫度250℃，毛細(xì)管電壓3500 V，噴嘴電壓500 V。

1.2.8 盆栽試驗(yàn) 玉米種子用0.4%的次氯酸鈉進(jìn)行表面消毒，用無菌蒸餾水沖洗4次，除去次氯酸鈉，再用55℃無菌蒸餾水浸種，30℃溫箱培養(yǎng)過夜后將種子轉(zhuǎn)入滅菌紗布上催芽。試驗(yàn)使用塑料盆 (18 cm ×15 cm × 15 cm)，每盆裝土壤750 g。供試土壤有四種，水稻土、黏性潮土、鹽潮土和石灰性潮土。供試磷源為三種，分別是Ca3(PO4)2、AlPO4和昆陽磷礦粉 (RP)，每種磷源用量為1.0 g/kg土壤。菌劑處理為：1) 對照 (CK)，加入滅菌草炭和Pikovskaya培養(yǎng)液；2) 接種溶磷菌P83；3) 接種溶磷菌M2。稱取菌劑1.50 g/盆，與2.25 g滅菌草炭混勻后，與土壤混合均勻。試驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方案。每個(gè)處理重復(fù)4次，共計(jì)144盆。溫室種植 (2014年3月28日種植，5月4日收獲，北京白天平均28℃，夜間平均18℃)，每盆播種2粒發(fā)芽的玉米種子。生長期間保持土壤濕度在65%～75%。采集玉米根際土壤樣品和收獲玉米植株，測定植株鮮重、干重和土壤有效磷含量。玉米品種為鄭單958。

1.2.9 小區(qū)試驗(yàn) 2014年5月在北京市唐家?guī)X布置了田間小區(qū)試驗(yàn)。供試菌株為M2、P83和ATCC20851為對照菌株，試驗(yàn)地面積為40 m2(10 m × 4 m)，將其劃分為1.8 m × 0.8 m的小區(qū)，每個(gè)小區(qū)接種菌劑300 g。菌劑處理為：1) 對照 (CK)，只加入滅菌草炭和Pikovskaya培養(yǎng)液；2) 接種ATCC20851溶磷菌劑；3) 接種P83溶磷菌劑；4) 接種M2溶磷菌劑。每個(gè)處理重復(fù)4次，溶磷菌劑與表層15 cm土壤混合均勻后培壟 (200 cm × 20 cm × 20 cm)，每個(gè)壟種植花生16棵，155 d收獲。測定花生植株鮮重和干重、花生果實(shí)鮮重和干重。將小區(qū)產(chǎn)量折合為每公頃的產(chǎn)量，收獲時(shí)采集花生根部土壤測定土壤有效磷含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)。利用SPSS 19.0軟件中的一般線性模型 (General Lineral Model for Univariate，GLM–Univariate) 進(jìn)行多因素方差分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 溶磷菌的篩選、鑒定

從向日葵根圍土壤樣品中共分離到5株溶磷真菌，其中真菌M2在無機(jī)磷培養(yǎng)基上生長良好，7天能夠?qū)? cm培養(yǎng)皿內(nèi)的無機(jī)磷全部溶解，說明該菌溶磷能力較強(qiáng)，故選擇菌株M2作為本試驗(yàn)的供試菌株。

菌株M2在PDA培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)，菌落生長迅速，菌絲體為白色，菌落中央有臍凸。3天后出現(xiàn)灰綠色分生孢子，5天時(shí)分生孢子多且極易脫落，無滲出液背面為淺黃色。顯微鏡下觀察到菌絲成束且無隔斷，呈帚狀枝單輪生，壁光滑。分生孢子為圓形，直徑約3 μm。

利用ITS rDNA特異引物對菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到562 bp的目的DNA片段，利用Blast軟件與GenBank的序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果顯示，菌株M2與草酸青霉 (Penicillium oxalicum) 的同源性達(dá)到99%。利用MEGA6的Neighbor-Joining軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 (圖1)，菌株M2與Penicillium oxalicum處于相同的發(fā)育地位，說明菌株M2與Penicillium oxalicum在ITS rDNA序列上具有高度的相似性，因此形態(tài)學(xué)和ITS序列鑒定結(jié)果一致，菌株M2為草酸青霉。

2.2 溶磷菌株M2的溶磷效果

2.2.1 溶磷菌株對不同難溶磷酸鹽的作用效果 接種溶磷菌株的溶磷量明顯高于對照 (表2)。以磷酸三鈣和磷酸鋁為磷源的處理中，接種溶磷菌株搖瓶中培養(yǎng)6 d，菌株溶磷量最高，菌株M2對磷酸三鈣和磷酸鋁的溶解率分別為59.2%和46.3%；菌株P(guān)83的溶解率分別為51.4%和6.29%。可見菌株M2對磷酸三鈣和磷酸鋁的溶解能力大于菌株P(guān)83，更顯著高于對照。

2.2.2 溶磷菌株對不同磷礦粉的作用效果 液體搖床培養(yǎng)條件下，以我國5種磷礦粉為磷源，接種菌株M2與菌株P(guān)83，結(jié)果顯示 (表3)，2株溶磷菌株的溶磷能力顯著高于對照，菌株M2的溶磷量顯著大于菌株P(guān)83。

圖 1 菌株M2基于ITS rDNA序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Molecular phylogenetic analysis of fungal strain M2 from ITS region

表 2 接種草酸青霉菌M2和斜臥青霉菌 P83的不同磷源培養(yǎng)液中有效磷含量 (mg/L)Table 2 Soluble P content in cultures of isolates M2 and P83 grown in PVK broth plus Ca3 (PO4)2 and AlPO4

表 3 5種磷礦粉接種M2和P83菌株6天后培養(yǎng)液中有效磷含量 (mg/L)Table 3 Soluble P content in cultures of isolates M2 and P83 plus 5 phosphorous rocks for 6 days incubation

綜上所述，菌株M2在磷酸三鈣、磷酸鋁和5種磷礦粉中的溶磷能力大于菌株P(guān)83；對磷酸三鈣的溶解能力大于磷酸鋁和磷礦粉。

2.3 磷菌株對難溶磷培養(yǎng)液pH值的影響

2.3.1 無機(jī)難溶磷液體培養(yǎng)基中pH值變化 在起始pH值為7.0的磷酸三鈣和磷酸鋁培養(yǎng)液中 (圖2)，菌株M2、P83與CK相比，溶液pH值明顯下降且差異顯著，但兩菌株對溶液pH值的影響差異不顯著。2.3.2 溶磷菌株對磷礦粉液體培養(yǎng)基pH值的影響溶磷菌M2和P83接種于分別使用5種磷礦粉的培養(yǎng)液體中，結(jié)果顯示，所有接種處理的溶液pH值皆比CK顯著下降 (表4)，但兩菌株對溶液pH值的影響差異不顯著。

2.4 溶磷菌株耐鹽能力測定

溶磷菌株M2、P83接入含NaCl 0、5%、10%和12.5%的培養(yǎng)基中，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中，從第3 d開始每日觀察并記錄菌落的生長狀況。與NaCl含量為0相比，在鹽含量為5%的培養(yǎng)基中，菌株P(guān)83的生長嚴(yán)重被抑制，而菌株M2的生長狀況與CK中相似；在鹽含量為7.5%時(shí)，菌株P(guān)83無生長，菌株M2的生長被輕度抑制；在鹽含量為10%時(shí)，菌株M2被嚴(yán)重抑制?？梢?，溶磷真菌M2最高可耐受7.5%的鹽濃度(表5)。

表 4 5種磷礦粉培養(yǎng)液中接種M2 和P83菌株 6 d 后pH值變化Table 4 Change in pH with incubation of isolates M2 and P83 in PVK broth with rock phosphates for 6 days

圖 2 PVK培養(yǎng)液接種M2和P83菌株后不同時(shí)間pH值變化Fig. 2 Change in pH over time with incubation of isolates M2 and P83 in PVK broth culture with Ca3(PO4)2 and AlPO4

2.5 溶磷菌在不同難溶磷源中的產(chǎn)酸能力

在3種難溶磷培養(yǎng)液中，菌株M2以分泌草酸和檸檬酸為主，其次為蘋果酸、乳酸和琥珀酸，微量的酒石酸和延胡索酸 (圖3)。菌株M2總有機(jī)酸分泌量 Ca3(PO4)2＞ 磷礦粉 ＞ AlPO4，分別為 999.95、911.55和778.27 mg/L。

2.6 不同難溶磷對溶磷菌分泌植物激素的影響

菌株M2接入分別含3種難溶磷培養(yǎng)液中，菌株M2生長素分泌量AlPO4＞ Ca3(PO4)2＞ RP，分別為66.17 mg/L、65.08 mg/L和32.38 mg/L；分泌玉米素含量在三種難溶磷中無明顯差異，含量為0.05～0.07 mg/L (表 6)。

2.7 溶磷真菌與難溶磷及不同土壤適配性

2.7.1 溶磷菌株對玉米盆栽土壤難溶磷的溶解效果接種菌劑M2和P83明顯提高土壤中有效磷含量(表7)。菌劑M2分別接種于4種土壤，有效磷含量皆高于對照和P83。試驗(yàn)結(jié)果表明，同一土壤同一菌

表 5 溶磷菌P83 和M2 在不同氯化鈉濃度培養(yǎng)基中的生長狀況 (5 d)Table 5 Impact of various NaCl concentrations on isolates P83 and M2 growth on PDA plates for 5 days incubation

圖 3 接種菌株M2的Ca3(PO4)2、AlPO4 和磷礦粉培養(yǎng)液中的有機(jī)酸含量 (培養(yǎng)6 d)Fig. 3 Organic acids produced by isolate M2 in PVK broth culture with 3 phosphates at 6 days incubation

表 6 不同磷源培養(yǎng)液接種M2菌株6天后吲哚乙酸和玉米素含量 (mg/L)Table 6 IAA and Zeatin produced by isolate M2 with 3 insoluble phosphates for 6 days incubation

劑不同磷源間，土壤有效磷含量差異不顯著；同一土壤同一磷源不同菌劑間，所有處理中接種菌劑M2和P83的土壤有效磷含量均顯著高于CK；菌劑M2對磷酸鋁和磷礦粉的溶解能力明顯優(yōu)于菌劑P83，但對磷酸三鈣的溶解能力差異不顯著；同一磷源同一菌劑不同土壤間土壤有效磷含量差異不顯著。以土壤種類為主要因素，對所有接種菌劑和不同磷源處理下的數(shù)據(jù)進(jìn)行平均，黏性潮土有效磷含量最高為32.93 mg/kg，表明溶磷菌劑M2和P83在黏性潮土中活化難溶磷的能力最強(qiáng)。接種菌劑和不接菌 (CK) 處理下，接種菌劑M2土壤有效磷含量最高 (33.06 mg/kg)。不同磷源處理下，以磷酸鈣為磷

源的土壤有效磷含量最高，為33.09 mg/kg，表明菌劑M2和P83在土壤中活化磷酸鈣的能力最強(qiáng)。4種土壤、2種菌劑和3種難溶磷源共36個(gè)處理中，以磷酸三鈣為磷源的黏性潮土接種菌劑M2，土壤有效磷含量最高，表明菌劑M2在黏性潮土中對磷酸三鈣的溶解效果最好。綜上說明，菌劑M2比菌劑P83對提高土壤有效磷具有顯著優(yōu)勢，菌劑M2與4種土壤的適配性均高于菌劑P83，具有較強(qiáng)應(yīng)用潛力。

表 7 盆栽玉米接種M2和P83菌株和供應(yīng)不同難溶磷源對4種土壤有效磷的影響Table 7 Impact of isolates M2 and P83 on soil available P influenced by soil types and insoluble P sources on corn plants in greenhouse pot studies

2.7.2 溶磷菌株對盆栽玉米植株的促生效果 對玉米生物量的影響與土壤有效磷含量相同，接種菌劑M2和P83能提高玉米生物量 (表8)。同種土壤中，接種菌劑M2的玉米生物量，均高于菌劑P83。4種土壤中接種菌劑和不同磷源處理下，水稻土中玉米生物量最高，鮮重、干重分別為33.31 g、5.12 g，表明菌劑M2和P83在水稻土中對玉米的促生效果最好。接種菌劑和不接菌 (CK) 處理下，接種菌劑M2的玉米生物量最高，鮮重、干重分別為23.73 g和3.75 g。水稻土中使用磷酸三鈣的同時(shí)接種菌劑M2，植株干重增長率最大 (262.94%)。接入菌劑M2與P83相比，M2的植株干重和鮮重都有增加。表明菌劑M2在4種土壤中對玉米生物量的促生效果好于菌劑P83。

綜上表明，菌劑M2對玉米生物量的作用效果優(yōu)于菌劑P83，菌劑M2與4種土壤的適配性均高于菌劑P83。

2.8 溶磷菌劑對花生產(chǎn)量及土壤有效磷含量的影響

2.8.1 溶磷菌劑對小區(qū)試驗(yàn)花生產(chǎn)量的影響 接種菌劑對花生的生長有明顯促生效果，對花生產(chǎn)量的促生效果為菌劑 M2 ＞ P83 ＞ ATCC20851 ＞ CK (表 9)。菌劑M2與ATCC20851相比，植株鮮重和干重分別提高3.02 t/hm2和0.63 t/hm2；與菌劑P83相比，分別增加1.06 t/hm2和0.57 t/hm2。綜上表明，添加菌劑M2對小區(qū)試驗(yàn)花生生物量的促生效果最好。

2.8.2 小區(qū)試驗(yàn)供試菌株對花生果實(shí)產(chǎn)量及土壤有效磷的影響 對花生果實(shí)的促生效果為菌劑M2 ＞ P83 ＞ATCC20851 ＞ CK。對花生果實(shí)產(chǎn)量影響最大的為菌劑M2，比CK花生果實(shí)鮮重、干重增產(chǎn)1.44 t/hm2和0.85 t/hm2；菌劑M2比菌劑ATCC20851處理的花生果實(shí)鮮重、干重增加10.41%和8.43%。添加菌劑能顯著提高土壤中有效磷含量 (表10)。對土壤中有效磷含量影響最大的為菌劑M2。綜上可見菌劑M2在小區(qū)試驗(yàn)中對花生產(chǎn)量以及土壤磷養(yǎng)分促進(jìn)效果最好。

3 討論

草酸青霉菌M2在液體搖瓶培養(yǎng)和土壤條件下，對多種難溶磷都表現(xiàn)出較強(qiáng)的溶解能力。現(xiàn)已報(bào)道的溶解磷酸三鈣較強(qiáng)的青霉菌株有P4 (P. oxalicum)[12]、P83 (P. decumbens)[29]和 FS23 (P. canescens)[50]，換算成培養(yǎng)基中加入磷酸三鈣5 g/L，培養(yǎng)液中最大可溶性磷含量分別為931.45、956和754 mg/L。菌株M2在加入5 g/L磷酸三鈣培養(yǎng)液中，有效磷最大濃度為971.87 mg/L，在溶解磷酸三鈣上要優(yōu)于上述菌株。以往研究表明，多數(shù)溶磷菌株對磷酸三鈣的溶解能力高于磷酸鋁和磷礦粉[13,41]。關(guān)于溶解磷酸鋁較好的溶磷真菌菌株已有較多報(bào)道，其中，菌株B1-A[51]、菌株FS1[50]和菌株Z60[52]對磷酸鋁溶解能力較強(qiáng)，水溶性磷最大濃度分別為942.3、713和624.1 mg/L，其他能溶解磷酸鋁的青霉菌株可溶性磷含量大多約100 mg/L[51–52]，草酸青霉菌M2對磷酸鋁的溶解量為987.74 mg/L，優(yōu)于菌株B1-A、FS1和Z60。報(bào)道顯示，液體培養(yǎng)中青霉菌溶解磷礦粉的能力為29～219 mg/L[9-10]，菌株M2溶解昆陽磷礦粉釋放的有效磷達(dá)555.83 mg/L。比較而言，菌株M2對磷礦粉的溶解能力高于已報(bào)道的多數(shù)菌株，僅略低于菌株An2[8]。菌株An2溶解磷酸鋁 (折合5 g/L) 的有效磷為1178 mg/L，高于菌株M2，但對磷酸三鈣和磷礦粉的溶解能力明顯低于菌株M2，菌株An2的最大溶解量分別為861 mg/L和89.5 mg/L；同時(shí)菌株M2對NaCl的最大耐受力為10%，而菌株An2僅能耐受5%的NaCl。迄今已報(bào)道耐鹽能力最強(qiáng)的溶磷菌株為PSF2[44]，可耐受12.5%的NaCl，菌株M2的耐鹽能力僅低于菌株P(guān)SF2。從溶磷能力而言，菌株P(guān)SF2僅能溶解磷酸三鈣 (521 mg/L)。因此，菌株M2不僅表現(xiàn)出高效的溶磷能力，而且具有一定的耐鹽能力。

菌株M2與4種典型土壤的適配性結(jié)果顯示，M2具有很強(qiáng)的將土壤難溶磷轉(zhuǎn)化為有效磷 (表7) 和促進(jìn)作物生長能力 (表8)。菌株M2與我國黏性潮土配合時(shí)生物量和有效磷含量最高，其次是與水稻土配合。接種M2于4種土壤中，所有接種M2處理的土壤有效磷均顯著增加，增加率最大值為310.95%(表7)，接種菌劑M2對玉米生物量最大增加率達(dá)262.94%，凸顯了菌劑M2優(yōu)良的促生效果。因此，M2在上述2種土壤中都能夠高效溶解土壤磷和外源加入的難溶磷，促進(jìn)作物生長，為M2生物肥料的生產(chǎn)應(yīng)用提供了重要依據(jù)。

目前，關(guān)于溶磷菌的溶磷機(jī)制一般被認(rèn)為是菌株在生長過程中產(chǎn)生低分子量有機(jī)酸，這些有機(jī)酸通過羥基或羧基與難溶性磷酸鹽上的鈣、鐵、鋁、鎂、鋅等金屬離子螯合，從而將難溶磷轉(zhuǎn)化成可溶性磷[9–10]。范丙全等[12]研究表明，草酸青霉菌P8在溶解磷礦粉時(shí)主要分泌蘋果酸 (56.6 mg/L)、乙酸 (69.3 mg/L) 和丙酸 (42 mg/L)；Yin等[11]研究結(jié)果與之相似，其還檢測到大量檸檬酸 (98.24 mg/L) 和少量其他7種少量有機(jī)酸，Li等[7]測定溶磷菌An2在5種難溶磷源中主要分泌的有機(jī)酸為草酸、酒石酸和琥珀酸。不同難溶磷種類影響菌株M2分泌總有機(jī)酸的含量，草酸青霉M2在磷酸鈣、磷酸鋁和磷礦粉培養(yǎng)液中檢測到7種有機(jī)酸，其中含量最高的為草酸 (653.46 mg/L) 和檸檬酸 (269.61 mg/L)，有機(jī)酸的總含量為778.27～999.95 mg/L。已有報(bào)道顯示，溶磷菌株分泌有機(jī)酸的含量范圍為12～1620 mg/L[8,12,53]。溶磷菌An2產(chǎn)生酒石酸的含量為880 mg/L，酒石酸為二羧酸，其溶磷能力高低取決于有機(jī)酸中羧基多少、螯合能力強(qiáng)弱[54]。本研究中菌株M2分泌的大量檸檬酸為三羧酸，此酸能大量螯合難溶磷中的金屬離子，從而有效釋放水溶性磷，是影響菌株M2高效溶磷能力的主要因素。

表 8 接種M2和P83菌株和供應(yīng)不同難溶磷源對4種土壤盆栽玉米生物量的影響Table 8 8 Impact of isolates M2 and P83 on corn plant fresh biomass influenced by soil types and insoluble P sources in greenhouse pot studies

表 9 田間花生接種M2，P83和ATCC20851菌劑對其秸稈產(chǎn)量的影響Table 9 Effect of M2, P83 and ATCC20851 biofertilizers on peanut straw yields in field study

表 10 不同溶磷菌生物肥料對田間花生產(chǎn)量和土壤有效磷的影響Table 10 Effect of M2, P83 and ATCC20851 biofertilizers on peanut seed yields and soil available P infield study

研究表明，溶磷微生物作為一類促生菌，能夠分泌一定量的植物激素 (主要為生長素IAA、赤霉素GA和細(xì)胞分裂素)，促進(jìn)作物生長[45]。本研究利用LC-MS法測定菌株M2在磷酸三鈣、磷酸鋁和磷礦粉供應(yīng)條件下分泌生長素和玉米素的含量最大值分別為66.17 mg/L和0.07 mg/L。已報(bào)道的溶磷菌株分泌IAA含量較高的菌種包括Penicillium、Aspergillus、Pseudomonas、Rhizopu和Trichoderma等，其中溶磷真菌分泌生長素的含量為2.5～42.53 mg/L[13,45]，且大多研究中僅測定溶磷菌株接入一種難溶磷培養(yǎng)液中吲哚乙酸 (IAA) 的分泌量，菌株M2分泌生長素的能力高于已報(bào)道的溶磷菌株。目前，還未見溶磷青霉菌分泌玉米素的報(bào)道。溶磷菌株M2具有高效的溶磷作用和分泌生長素、玉米素，從而表現(xiàn)出對玉米和花生良好的促生增產(chǎn)效果。因此，具有溶磷、促生和耐鹽多功能的草酸青霉M2，有望不遠(yuǎn)的將來，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮巨大的增產(chǎn)節(jié)肥作用。

4 結(jié)論

1) 篩選到一株耐鹽、高效溶磷真菌M2，鑒定為草酸青霉菌 (Penicillium oxalicum)，該菌株在7.5%NaCl的固體培養(yǎng)基中生長正常。

2) 液體培養(yǎng)條件下，草酸青霉菌M2能夠溶解磷酸三鈣、磷酸鋁和5種磷礦粉，溶解率達(dá)48.20%～60.26%，溶解能力顯著高于已報(bào)道的具有高效溶磷能力的菌株斜臥青霉菌P83。

3) 玉米盆栽試驗(yàn)中，北京石灰性潮土、安徽黏性潮土、安徽水稻土和山東沿海鹽潮土4種土壤中分別施入磷酸三鈣、磷酸鋁和開陽磷礦粉，土壤有效磷提高21.80～25.28 mg/kg，增長率達(dá)204.5%～311.0%。接種M2菌劑的玉米鮮重提高26.4%～99.2%，干重提高20.0%～262.9%。菌劑M2與4種土壤的適配性均高于菌劑P83，菌株M2與黏性潮土適配性最好。

4) 菌株M2在磷酸三鈣、磷酸鋁和磷礦粉3種難溶磷培養(yǎng)液中，分泌的有機(jī)酸總含量為778.27～999.95 mg/L，主要為草酸和檸檬酸；生長素含量為32.38～66.17 mg/L；玉米素含量為0.05～0.07 mg/L。有機(jī)酸是菌株M2溶磷的主要機(jī)制，生長素和玉米素是促進(jìn)作物生長和增產(chǎn)的主要因素。

5) 接種M2菌劑顯著提高花生產(chǎn)量，比拜萊青霉菌 (ATCC20851) 菌劑增產(chǎn)8.4%，比斜臥青霉菌P83菌劑增產(chǎn)5.4%，比不接菌 (CK) 增產(chǎn)23.3%。

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