六安市2010至2015年流感病原學檢測及流行病學分析

姜正好 楊 衛(wèi) 張 鳳 高大維 常宏偉

流感是由流感病毒引的一種急性呼吸道傳染病，能引起廣泛流行的流感病毒主要為A型和B型[1]。由于流感病毒感染人群較廣，潛伏期短，通過空氣飛沫傳播，因而極易引起流行，是第一個進行全球監(jiān)測的傳染病[2]，六安市于2009年開展流感病毒核酸檢測工作，并加入了國家流感監(jiān)測網(wǎng)。由于流感病毒表面抗原易發(fā)生變異，人群對變異株普遍易感，控制難度大，每年都有不同的流感亞型在某一地區(qū)流行。本文通過六安市2010～2015年流感監(jiān)測數(shù)據(jù)，從流感核酸檢測、流感亞型流行、流感時間分布、年齡性別分布等方面進行分析，進一步掌握流感病毒的活動規(guī)律及流行特征，以便有效控制流感的暴發(fā)和流行。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年1月至2015年12月中國疾病預防控制系統(tǒng)“中國流感信息系統(tǒng)”流感監(jiān)測數(shù)據(jù)中六安市15 435 流感樣病例(influenza-like illness，ILI)資料，其中采樣檢測的咽拭子標本3 890份。按照《全國流感監(jiān)測方案(2010年版)》[3]選取六安市人民醫(yī)院(哨點醫(yī)院)發(fā)病3 d內的ILI咽拭子標本，每周隨機采集5份以上咽拭子標本放入含3～5 mL病毒采樣液中，于4℃保存，并于48 h內運送至市疾控中心流感網(wǎng)絡實驗室，進行核酸檢測和/或病毒分離。納入標準：患者體溫≥38℃，伴有咳嗽或咽痛，缺乏其他實驗室確診依據(jù)。

1.2 設備試劑 采用德國產(chǎn)QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA)試劑提取流感病毒核酸,反應體系采用QIAgen one-step RT-PCR Kit (Cat.no.210212)。試劑包括Goldview DNA 核酸染料(北京賽百盛基因技術有限公司生產(chǎn))，6×上樣緩沖液和DL 2 000DNA Mark[寶生物工程有限公司(大連)生產(chǎn)]。引物序列由安徽省疾控中心提供, 并由上海生物工程技術服務有限公司合成。核酸擴增儀 2720和熒光PCR儀7500 fast 均由AB公司生產(chǎn)，電泳儀(北京六一廠生產(chǎn))，全自動凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad生產(chǎn))。

1.3 檢測方法 2013年4月之前的標本用逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)方法，對采集ILI的咽拭子標本，提取流感病毒核酸后擴增相應目的片段。20 μL的擴增反應體系包含: 5 μL 5×RT-PCR 緩沖液, 1 μL混合酶；1 μL 10 mM 脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)，0.1 μL酶抑制劑；上下游引物各1 μL；10.9 μL無核酸水。配制完成混勻后加入5 μL的核酸提取物。擴增產(chǎn)物經(jīng)熒光素染色后瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀下觀察特異性片段，判斷結果。

2013年4月之后的標本采用熒光定量PCR方法，流感病毒核酸提取同RT-PCR方法，提取的核酸加入擴增反應體系。20 μL的擴增反應體系包含: 19 μL核酸熒光PCR檢測混合液(含1對引物、2條探針及RT-PCR混合液)和1 μL RT-PCR酶(含逆轉錄酶和Taq DNA聚合酶)。配好后混勻，加入5 μL 核酸提取物，按照說明書設置參數(shù)，擴增曲線與閾值焦點對應的循環(huán)數(shù)(cycle threshold, Ct)值≤38，判為陽性。

1.4 觀察指標 記錄分析2010年1月至2015年12月流感病毒型別分布、季節(jié)分布、暴發(fā)疫情和病毒分離，以及人群特征(性別、年齡)；同時分析哨點醫(yī)院流感樣病例在門診病例的占比情況。

1.5 統(tǒng)計學方法 運用SPSS 21.0軟件對相關數(shù)據(jù)進行分析，Excel 2007建立數(shù)據(jù)庫繪制數(shù)據(jù)曲線。計數(shù)資料以率或構成比表示，采用χ2檢驗，以P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 流感核酸檢測結果 ILI咽拭子標本3 890份中，檢測出流感病毒核酸陽性422份，總陽性率10.85%(422/3 890)。分析流感病毒亞型，A型313份(74.17%)，B型109份(25.83%)。A型中，季H3占54.27%(229/422)，新甲H1占12.56%(53/422)，季H1僅占0.47%(2/422)，A未分型占6.87%(29/422)。

2.2 流感流行年度分布 2012年以前流感病毒核酸檢出陽性率均>10.00%，2012年最高，達17.74%；2013年以后均<10.00%，2013年最低，僅為7.61%。從流感病毒亞型年度分布來看，季H3和B型年度分布比較均勻。新甲H1在2012年和2015年均未被檢出。季H1僅在2010年和2011年分別檢出1份陽性。流感亞型的年度分布差異有統(tǒng)計學意義(χ2=139.866，P<0.001)。詳見表1。

表1 2010～2015年六安市流感病毒核酸檢測分型結果比較[例(%)]

2.3 流感病毒陽性率季節(jié)分布比較 4～7月和10～11月流感病毒陽性率低于5.00%，其他月份均>10.00%。流感病毒陽性檢測時間分布呈現(xiàn)明顯雙峰，分別為7～9月和12月至次年3月。流感病毒亞型陽性月份分布存在差異，新甲H1和B型呈單峰特征，季H3呈雙峰特征。由于季H3陽性率較高，導致流感病毒總體陽性率呈現(xiàn)雙峰特征。流感病毒陽性率月份差異有統(tǒng)計學意義(χ2=674.522，P<0.001)。詳見表2、圖2。

表2 不同月份流感病毒不同型別核酸檢測陽性情況比較[例(%)]

圖2 六安市2010～2015年流感不同亞型月份分布

2.4 流感疫情暴發(fā)情況 2010～2015年，全市報告3起流感暴發(fā)疫情，均發(fā)生于中小學學生，時間分別為2010年1月、2011年3月、2013年12月，均在冬春季。實驗室流感核酸檢測結果顯示，引起流感暴發(fā)流行的2例為季H3，1例為B型。

2.5 哨點醫(yī)院ILI就診分布 2010～2015年六安市人民醫(yī)院第二門診部就診438 379人次，其中，ILI 14 127人次(3.24%)。2010～2015年流感樣病例占就診人數(shù)分別為2.21%、2.58%、2.75%、3.73%、3.37%和4.30%。流感發(fā)病有多個高峰，分別出現(xiàn)在2013年4～7月、2014年1月、2014年5月、2015年5～8月、2015年12月，月就診人數(shù)均超過300人，2015年7月最高，達437人。

2.6 流感病毒核酸陽性標本年齡分布 各年齡組均有流感病毒核酸陽性病例，0～4歲年齡組和25～59歲年齡組陽性率構成比最高，均為23.70%，≥60歲年齡組陽性率構成比最低，不同年齡組陽性率差異有統(tǒng)計學意義(χ2= 196.275，P<0.001)。詳見表3。

表3 六安市2010～2015年各年齡組流感病毒檢測情況比較

注：ILI為流感病例

2.7 流感病毒核酸陽性標本性別分布 422份流感病毒核酸陽性標本，男性陽性率11.13%(235/2 111)，女性陽性率為10.57%(187/1 769)，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.313，P=0.576)。

2.8 流感病毒分離 178例樣本共分離123株流感毒株，其中，A型流感毒株95株，B型流感毒株(以B-Yamagata系為主)28株。季H3、新甲H1、B型流感病毒分離陽性率分別為74.11%、50.00%和66.67%，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=5.532，P=0.063)。2012～2015年流感病毒檢測陽性率總體呈增高趨勢，2015年達92.16%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=40.205，P<0.001)。詳見表4。

表4 流感亞型病毒分離陽性率比較

3 討論

流感病毒的傳播途徑包括接觸傳播、飛沫傳播及被污染物品的接觸傳播等[4]。由于流感病毒薄膜上的血凝素和神經(jīng)氨酸酶都易發(fā)生抗原性漂移和抗原性轉變，同時流感病毒亦可發(fā)生基因突變和重組形成新的亞型，接種流感疫苗也不能對所有的流感型別進行免疫保護，所以流感病毒容易引起大流行。

六安市2010～2015年流感監(jiān)測結果表明，本地區(qū)的流感主要以A型中的季H3為主，占70.85%(229/422)；B型流感次之，占25.83%；而新甲H1的年度分布差異明顯， 2012年和2015年全年均未檢出新甲H1，與河北省報道流感亞型流行基本一致[5]。但桂林市報道流感病毒陽性率高于我市，而且流感主要以B型為主，發(fā)病高峰集中在3～5月，與我市差別較大[6]，可能與桂林屬低緯度地區(qū)有關。而ILI核酸檢測陽性率在冬季和夏季比較高，陽性率為17.74%(323/1 821)，春秋季反而較低，陽性率僅為4.78%(99/2069)，與全國其他地市不完全一致[7-10],呈明顯的雙峰，所以每年要做好7月和12月流感高發(fā)季節(jié)來臨之前的防控工作。

從流感亞型核酸陽性分布來看，季H3在冬季和夏季核酸陽性率較高，達10.65%(195/1 821)，而春季和秋季流感核酸陽性率僅為1.69%(35/2 069)，也影響了流感病毒核酸總陽性率，而新甲H1和B型的陽性率冬春季較高，陽性率達7.52%(149/1 981)，與全國一些地市報道一致[7,11]。

流感監(jiān)測是預防和控制流感流行的關鍵措施之一，我國所有的地級市均建立了流感網(wǎng)絡實驗室[12]。從六安市的流感監(jiān)測數(shù)據(jù)來看，5歲以下兒童和25～59歲年齡組流感核酸陽性病例比重較高，但從流感樣病例核酸檢測陽性率來看，15～24歲年齡組陽性率最高，為8.25%(87/1 054)，而丹東地區(qū)報道5～14歲年齡組陽性率最高，可能由于其他年齡組標本過少[14]。30歲以上，感染流感新甲H1亞型后，易引起較為嚴重的呼吸困難癥狀[14]。分析發(fā)現(xiàn)六安市男女流感核酸檢測陽性率差異無統(tǒng)計學意義，與鷹潭市報道一致[7]。

從近六年流感哨點醫(yī)院ILI就診人數(shù)得出就診人數(shù)升高滯后于流感檢測陽性率升高。提示流感監(jiān)測可以為全市的流行高峰起到預警和指導作用[10]。由此可見，ILI就診人數(shù)的增減與流感病毒核酸檢測陽性率并不一致，主要源于患者就診的滯后[15]。

六安市流感網(wǎng)絡實驗室于2009年8月開展工作，用普通RT-PCR進行流感病毒核酸檢測，155份咽拭子標本流感病毒核酸陽性其中29份為A未分型，占18.71%(29/155)，低于鷹潭市的報道[7]。這主要是由于普通PCR檢測技術的靈敏度和特異性都不高、影響因素多引起的。自2013年購置熒光定量PCR以后，所有的流感陽性標本均能夠分型，可見熒光定量PCR法在核酸檢測方面準確度高，同時檢測過程也更方便，是流感網(wǎng)絡實驗室不可缺少的檢測設備。

流感實驗室檢測，是為流感監(jiān)測提供可靠的病原學數(shù)據(jù)，是分析流感流行病學特征的重要依據(jù)，是有效控制流感流行的必要措施。流感實驗室檢測設備和人員技術力量是流感檢測能力的必要保證，六安市的流感病毒分離陽性率較高，達69.10%(83/112)，高于其他省市[11,16-17]。

六安市處于亞熱帶濕潤季風氣候，一年四季分明，季節(jié)變化明顯，是流感易于流行的地區(qū)。本研究通過對2010～2015年流感病原學檢測及國家流感監(jiān)測網(wǎng)絡數(shù)據(jù)，綜合分析六安市流感流行病學特征流行病特征，對了解本地流感的流行規(guī)律及防控對策提供了一定的理論依據(jù)。不斷加強流感重點人群及病原學的監(jiān)測，提前發(fā)現(xiàn)潛在的流感病毒暴發(fā)或流行，可為制定流感防控策略和措施提供有力依據(jù)。

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