水凝膠支架在組織工程軟骨中的應(yīng)用進(jìn)展

梁亮 閆飛

[摘要]軟骨損傷、退變是骨科的常見疾病，常導(dǎo)致關(guān)節(jié)的疼痛、功能障礙，甚至造成殘疾。軟骨缺損的修復(fù)、再生成為了醫(yī)學(xué)界的難題之一，而組織工程的快速發(fā)展為這個問題提供了新的解決思路和方案。水凝膠支架由于其結(jié)構(gòu)與天然細(xì)胞外基質(zhì)相近，利于種子細(xì)胞存活，植入創(chuàng)傷小，可以填充任何形狀缺損并與宿主軟骨緊密結(jié)合等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于組織工程軟骨的研究中。本文現(xiàn)就不同材料所構(gòu)建的水凝膠支架在組織工程軟骨中的應(yīng)用進(jìn)展作一綜述。

[關(guān)鍵詞]水凝膠；軟骨；組織工程

[中圖分類號] R681 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）4（b）-0025-04

Application of hydrogel scaffolds in tissue engineering cartilage

LIANG Liang1 YAN Fei2▲

1.Guizhou Medical University，Guizhou Province，Guiyang 550000，China；2.Department of Orthopedics，the Third Affiliated Hospital of Guizhou Medical University，Guizhou Province，Duyun 558000， China

[Abstract]Cartilage injury and degeneration are common diseases which often lead to joint pain，dysfunction，and even disability.The repair and regeneration of cartilage defects has become a significant challenge，the rapid development of tissue engineering provides a new scheme for this problem.Hydrogel scaffolds are widely used in tissue engineering cartilage because of their similar structure with natural extracellular matrix，favorable for survival of seed cells，small trauma to implant，filling of any shape defect and closely connection with the host cartilage.This article reviews the progress of the application of hydrogel scaffolds constructed by different materials in tissue engineering cartilage.

[Key words]Hydrogel；Cartilage；Tissue engineering

軟骨損傷、退變是骨科的常見疾病，常導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛、功能障礙甚至造成殘疾[1]。由于軟骨組織沒有血管、神經(jīng)及淋巴組織，在損傷、退變后難以自我修復(fù)，軟骨缺損的修復(fù)、再生成為了醫(yī)學(xué)界的亟需解決的難題之一。而近年來組織工程的快速發(fā)展為這個問題提供了新的解決思路和方案[2]。

組織工程是再生醫(yī)學(xué)的一個重要領(lǐng)域，自20世紀(jì)80年代至今已經(jīng)過30年的研究、發(fā)展。其為由各種先天性畸形、慢性退變和創(chuàng)傷所損害的組織和器官的修復(fù)提供了新的希望[3]。組織工程由種子細(xì)胞、支架材料、生長因子三個要素構(gòu)成。由于軟骨缺損在臨床環(huán)境中通常是不規(guī)則的，所以可以填充任何形狀缺損并與宿主軟骨緊密結(jié)合的可塑性支架成為了組織工程軟骨支架的研究熱點[4]。

水凝膠是一類具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的聚合物，在水中能夠吸收大量水分而溶脹，并在溶脹之后能夠繼續(xù)保持其原有結(jié)構(gòu)而不被溶解。因其三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)與天然細(xì)胞外基質(zhì)相近；富含水分，利于種子細(xì)胞的存活，可在液態(tài)時微創(chuàng)注射至體內(nèi)再形成半固態(tài)的膠體從而減少植入創(chuàng)傷等獨特優(yōu)勢，已作為一類廣泛應(yīng)用于骨、軟骨等各類組織工程的研究中的支架[5]。本文將對不同材料所構(gòu)建的水凝膠支架在組織工程軟骨的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行介紹。

1天然來源材料

1.1透明質(zhì)酸（HA）

HA是軟骨細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的主要成分，以其特有的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮多種重要的生理功能，如潤滑關(guān)節(jié)，調(diào)節(jié)血管壁的通透性，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、水電解質(zhì)擴(kuò)散及運轉(zhuǎn)，促進(jìn)創(chuàng)傷愈合等[6]。臨床也常用關(guān)節(jié)腔注射透明質(zhì)酸以治療早期骨關(guān)節(jié)炎。其是由單位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺組成的高級多糖，之間由β-1，3-配糖鍵相連，雙糖單位之間由β-1，4-配糖鍵相連。Zhu等[7]通過肼修飾的適應(yīng)性彈性蛋白樣蛋白（ELP-HYD）和醛修飾的透明質(zhì)酸（HA-ALD）之間的反應(yīng)通過動態(tài)腙鍵產(chǎn)生適應(yīng)性彈性蛋白樣蛋白質(zhì)透明質(zhì)酸（ELP-HA）水凝膠。將軟骨細(xì)胞封裝在具有不同HA濃度的ELP-HA水凝膠中，發(fā)現(xiàn)增加HA濃度導(dǎo)致軟骨標(biāo)記基因表達(dá)的劑量依賴性增加和人硫酸鹽粘多糖（sGAG）沉積增強，同時最小化不希望的纖維軟骨表型。可作為3D支架廣泛應(yīng)用于組織修復(fù)。Ha等[8]在6個小型豬每個膝關(guān)節(jié)的滑車中制造了全厚度的軟骨損傷。3周后將人類臍帶血源性間充質(zhì)干細(xì)胞（hUCB-MSC）和4%HA水凝膠復(fù)合物的混合物移植到右膝上的缺損處。在左膝上以相同方式產(chǎn)生的骨軟骨缺損未經(jīng)治療作為對照。術(shù)后12周處死豬，通過大體和組織學(xué)分析評估隨后軟骨再生的程度。與對照膝相比，移植組的膝關(guān)節(jié)存在更良好的透明軟骨再生。

1.2殼聚糖

殼聚糖（chitosan）是由自然界廣泛存在的幾丁質(zhì)經(jīng)過脫乙酰作用得到，化學(xué)名稱為聚葡萄糖胺（1-4）-2-氨基-β-D葡萄糖，自然界中來源廣泛，其結(jié)構(gòu)與ECM中的糖胺聚糖相似。因為其優(yōu)異的生物相容性和生物降解性，成為組織工程中有吸引力的生物材料[9]。Martins等[10]通過關(guān)節(jié)鏡在6只馬的膝關(guān)節(jié)表面產(chǎn)生骨軟骨缺損，缺損填充了殼聚糖-甘油磷酸（GP）水凝膠。收集處理被去除的軟骨碎片作為對照，從組織學(xué)、免疫組織化學(xué)和蛋白聚糖的代謝標(biāo)記進(jìn)行分析。180 d后收集殼聚糖-甘油磷酸水凝膠修復(fù)的組織進(jìn)行分析，未檢測到巨噬細(xì)胞和多形核細(xì)胞，提示無明顯炎癥。修復(fù)組織允許細(xì)胞生長，這些細(xì)胞能夠合成類似于在正常軟骨中的Ⅱ型膠原和PG，提示其軟骨細(xì)胞性質(zhì)。Choi等[11]通過將Ⅱ型膠原蛋白與可注射藍(lán)光誘導(dǎo)型殼聚糖（MeGC）水凝膠共價共軛，成功地調(diào)節(jié)了在血清和細(xì)胞復(fù)雜生物環(huán)境中轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）的遞送。該水凝膠系統(tǒng)通過在體外封裝脂肪來源的干細(xì)胞來支持軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的凝結(jié)和沉積，提示這些TGF-β1功能化水凝膠系統(tǒng)在復(fù)雜的愈合環(huán)境中促進(jìn)軟骨再生的能力。

1.3絲素蛋白

絲素蛋白是從蠶絲中提取的天然高分子纖維蛋白，含量占蠶絲的70%～80%，富含甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸等多種氨基酸。因其具有良好的機(jī)械性能和理化性質(zhì)，如良好的柔韌性和強度、透氣透濕性、緩釋性等，經(jīng)過不同加工方法可加工成纖維、溶液、粉、膜以及凝膠等，并具極佳的生物相容性，被認(rèn)為是組織工程支架理想的天然生物材料[12]。Yodmuang等[13]使用由絲微纖維和絲素水凝膠制成的絲纖維復(fù)合水凝膠支架，模擬天然軟骨的膠原纖維和蛋白多糖復(fù)合結(jié)構(gòu)，制造了具有天然軟骨組織平衡模量的軟骨構(gòu)建體。在該復(fù)合水凝膠支架上培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，觀察到優(yōu)良的軟骨細(xì)胞反應(yīng)，培養(yǎng)42 d后與空白的絲狀水凝膠相比，具有更好的機(jī)械穩(wěn)定性。提示絲素蛋白作為用于軟骨組織修復(fù)的復(fù)合支架材料的功能性。Mirahmadi等[14]加入了切斷的絲素纖維和電紡絲素纖維到熱敏殼聚糖/甘油磷酸酯水凝膠，通過流變儀和小瓶傾斜法分析水凝膠的凝膠化溫度和凝膠化時間。通過單軸壓縮、壓痕和動態(tài)力學(xué)分析測定法測量機(jī)械表征，然后從新西蘭白兔的膝關(guān)節(jié)獲取軟骨細(xì)胞，在構(gòu)建體中培養(yǎng)，評估了細(xì)胞的增殖、活力及糖胺聚糖（GAG）和Ⅱ型膠原蛋白（ColⅡ）的產(chǎn)生。結(jié)果提示，當(dāng)水凝膠與兩層電紡絲素纖維混合時，其機(jī)械性能顯著增強。細(xì)胞種子支架中GAG和膠原Ⅱ型的結(jié)果提示支持軟骨細(xì)胞的生長。

1.4膠原蛋白

膠原蛋白是哺乳動物體內(nèi)含量最多、分布最廣的功能性蛋白，是ECM的重要組成成分，其結(jié)構(gòu)為由三條多肽鏈構(gòu)成的三股螺旋結(jié)構(gòu)，或稱膠原域。因其具有良好的生物降解性，生物相容性好，且具有較低的免疫原性，膠原蛋白海綿、膠原蛋白凝膠均在軟骨組織工程研究中得到廣泛應(yīng)用，并被認(rèn)為是組織工程的標(biāo)準(zhǔn)支架材料[15]。Smeriglio等[16]從全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)患者獲得的骨關(guān)節(jié)炎（OA）軟骨組織中分離得到正常軟骨細(xì)胞和OA軟骨細(xì)胞。觀察到可溶性ColⅥ刺激軟骨細(xì)胞增殖，并且正常及OA軟骨細(xì)胞以類似的方式對可溶性ColⅥ作出反應(yīng)。然而，增殖效應(yīng)僅由可溶性ColⅥ引起，因為在將軟骨細(xì)胞暴露于固定化的Col Ⅵ時未觀察到增殖。ColⅥ擴(kuò)增的軟骨細(xì)胞在3D仿生水凝膠構(gòu)建體中顯示與工程軟骨中未處理的軟骨細(xì)胞相似的潛力。Uto等[17]將移植和宿主基因背景最接近（同源75%）或相同（100%）的小鼠多能干細(xì)胞（iPS）嵌入膠原蛋白水凝膠，植入膝關(guān)節(jié)缺損模型中。在移植8周時，雖然與宿主背景同源性為75%的iPS細(xì)胞趨向于形成畸胎瘤，但同源性為100%的iPS細(xì)胞表現(xiàn)為聯(lián)合再生，GFP免疫組化證明移植的iPS細(xì)胞負(fù)責(zé)骨和軟骨的修復(fù)。

1.5藻酸鹽

藻酸鹽是一種來源于褐藻細(xì)胞壁的親水性線性多糖，遇二價陽離子即可發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)快速形成水凝膠。其來源廣泛，成膠反應(yīng)溫和，并具有相對較好的機(jī)械性能及良好的生物相容性，且能提供有利于細(xì)胞成長、有利于細(xì)胞間大分子物質(zhì)擴(kuò)散及細(xì)胞間信號傳到的3D微環(huán)境，故成為了組織工程中廣泛用于封裝種子細(xì)胞的支架材料[18]。Xu等[19]開發(fā)了非接觸共培養(yǎng)模式的組合，將人或兔MSC和兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞（rAC）封裝在3D藻酸鹽水凝膠珠中或在單層（2D）中培養(yǎng)，隨后在Transwell系統(tǒng)中共培養(yǎng)。其后對軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞形態(tài)、生長、沉積和rAC的基因表達(dá)進(jìn)行研究，提示了MSC與rAC之間明確的旁分泌作用，證明MSC可以下調(diào)軟骨細(xì)胞分化及在軟骨修復(fù)中的作用。

1.6富血小板血漿（PRP）

PRP，是全血經(jīng)離心后得到的血小板濃縮物，生物相容性好，如采用自體全血則無免疫原性、無炎癥反應(yīng)等負(fù)面影響。其含有大量蛋白質(zhì)，并含有大量生長因子，如血小板源生長因子（PDGF）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）、血小板源表皮生長因子（PDEGF）、血小板源血管生長因子（PDAF）、胰島素生長因子-1（IGF-1）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等[20]。因上述優(yōu)點以及易于獲取的特點，在組織工程研究中得到普遍應(yīng)用。Lee等[21]將原代分離的大鼠軟骨細(xì)胞在PRP/水凝膠復(fù)合材料中培養(yǎng)后，植入大鼠劍突軟骨中心圓柱型軟骨缺損，術(shù)后第7天處死大鼠，并進(jìn)行組織化學(xué)和免疫組化評估。提示劍突軟骨細(xì)胞在復(fù)合水凝膠中增殖良好。在含PRP的水凝膠中，缺損處顯示早期于梭形細(xì)胞周圍形成大量軟骨基質(zhì)，這些結(jié)果與蛋白聚糖的Safranin-O染色和Ⅱ型膠原蛋白的免疫組化相一致。體外基因表達(dá)分析顯示PRP/水凝膠植入物通過顯著增加CB1并上調(diào)ChM-1抗炎，為透明性軟骨再生提供了合適的環(huán)境。

2人工合成材料

2.1低聚乙二醇富馬酸酯（OPF）

OPF水凝膠是由聚乙二醇和延胡索酸酯與聚乙二醇二丙烯酸酯通過化學(xué)交聯(lián)所得，相比其他水凝膠具有更高的含水量，甚至相較一些天然來源材料如明膠、透明質(zhì)酸等具有更好的組織相容性和生物可降解性[22]，是一種經(jīng)過深入研究的支架。Hui等[22]在12只8月齡的小型豬建立24處軟骨缺損，實驗組（n=12）植入再水合的凍干OPF水凝膠支架，對照組無植入物。術(shù)后2個月和4個月進(jìn)行組織學(xué)檢查，實驗組支架本身在2個月和4個月時對新組織填充的比例分別增加了58%和54%，并且透明質(zhì)酸在4個月時占新組織的39%。提示再水合凍干OPF水凝膠支架在豬軟骨缺損模型中增強了透明-纖維軟骨混合修復(fù)組織的形成。Girolamo等[23]在7只成年小型豬右側(cè)膝關(guān)節(jié)滑車周邊部分建立4處缺損（n=28），在實驗組采用種植了自體或人脂肪干細(xì)胞（ASCs）的OPF水凝膠復(fù)合物填充，對照組單獨用OPF水凝膠填充。6個月后在實驗組中觀察到具有更好的生物力學(xué)性質(zhì)和較高的Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)的軟骨組織。

2.2聚乙烯醇（PVA）

PVA是一種極安全的高分子有機(jī)物，具有良好的生物相容性。PVA水凝膠在眼科、傷口敷料和人工關(guān)節(jié)方面均有廣泛應(yīng)用。因其具有與關(guān)節(jié)軟骨、半月板相當(dāng)?shù)恼硰椥誀?，被認(rèn)為是軟骨組織工程中具有吸引力的材料[24]。但相比其他水凝膠，其蛋白吸附量較低，不利于細(xì)胞附著。Blum等[25]使用兩種不同的凝膠加工技術(shù)來制備水凝膠。第一種方法將邊界潤滑劑官能化聚乙烯醇，然后將聚合物通過物理交聯(lián)反應(yīng)形成水凝膠。第二種方法是形成非官能化聚乙烯醇水凝膠，然后在凝膠上進(jìn)行官能化反應(yīng)。收集軟骨樣品，以比較邊界潤滑劑官能化水凝膠與非官能化水凝膠和天然軟骨的機(jī)械和摩擦學(xué)性能。摩擦實驗提示官能化水凝膠的摩擦系數(shù)較純PVA降低了70%。壓痕研究了水凝膠的彈性模量，提示水凝膠的穩(wěn)定性受加工方法的影響，顯示邊界潤滑劑官能化PVA水凝膠作為仿生合成關(guān)節(jié)軟骨替代物的潛力。

人工合成材料種類繁多，其他如降冰片烯、聚乳酸（PLA）、聚L-丙交酯-己內(nèi)酯（PLCL）等相對應(yīng)用較少，文中不再贅述。

3問題與展望

軟骨損傷是骨科常見的疾病，目前常用的藥物、手術(shù)等治療手段都難以促進(jìn)軟骨的再生修復(fù)，因此通過組織工程技術(shù)修復(fù)軟骨損傷成為了研究的熱點。其中，組織工程軟骨支架，尤其是能夠根據(jù)缺損形狀塑形的水凝膠支架的制備成為了研究的重點。隨著材料學(xué)不斷發(fā)展，用于構(gòu)建組織工程軟骨支架的材料種類繁多，單一的材料由于自身理化特性的局限難以單獨進(jìn)行構(gòu)建，故目前的研究多采用多種材料構(gòu)建的復(fù)合支架以取長補短，經(jīng)過多年的研究與應(yīng)用，組織工程軟骨水凝膠支架在體內(nèi)及體外實驗均已取得可觀的成果，但仍存在著種種難題需要進(jìn)一步研究以期得到解決，如何提高和保持支架材料力學(xué)性能及表面活性，尤其是在體內(nèi)動態(tài)的力學(xué)環(huán)境內(nèi)；如何控制支架的降解速度與軟骨修復(fù)速度的平衡，以及支架在體內(nèi)降解產(chǎn)物對機(jī)體的影響；如何使再生的軟骨組織與基底骨組織達(dá)到正常的過渡以及與周圍原有軟骨組織的長合；如何降低同種異體組織來源甚至異種組織來源的材料的免疫原性、炎癥反應(yīng)以及如何有效地滅菌以降低感染、傳染性疾病傳播的風(fēng)險。

盡管面臨諸多困難，但通過探索新型材料的應(yīng)用以及進(jìn)一步研究現(xiàn)有材料通過不同復(fù)合方式、復(fù)合比例及不同的交聯(lián)方法，并且通過3D打印等制備技術(shù)的應(yīng)用，仍有望得到更為符合人體軟骨天然結(jié)構(gòu)及功能的水凝膠支架，實現(xiàn)組織工程軟骨的臨床應(yīng)用，為軟骨損傷患者帶去希望。

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（收稿日期：2017-10-20 本文編輯：閆 佩）