高效液相色譜法同時測定黃芪護肝膠囊中7種活性成分的含量

紀國力 劉斌

[摘要]目的 建立高效液相色譜法（HPLC）同時測定黃芪護肝膠囊中延胡索乙素、芍藥苷、丹參酮ⅡA、橙皮苷、大黃素、五味子醇甲、大黃酚等主要成分含量的方法。方法 采用HPLC檢測黃芪護肝膠囊中延胡索乙素、芍藥苷、丹參酮ⅡA、橙皮苷、大黃素、五味子醇甲、大黃酚等主要成分，色譜柱為CNW Athena C18型，流動相為甲醇（A）和0.1%的磷酸水溶液（B），梯度洗脫；流速為1.0 ml/min；柱溫為30℃；檢測波長中，延胡索乙素為210 nm，芍藥苷、橙皮苷和五味子醇甲為230 nm，丹參酮ⅡA、大黃素和大黃酚為265 nm?？疾鞕z測黃芪護肝膠囊中各檢測成分的線性范圍、回收率和可重復性。結(jié)果 延胡索乙素、芍藥苷、橙皮苷、五味子醇甲、丹參酮ⅡA、大黃素和大黃酚的線性范圍分別為1.26～25.20 μg/ml（r=0.9996）、7.03～140.60 μg/ml（r=0.9998）、3.63～72.60 μg/ml（r=0.9997）、2.11～42.20 μg/ml（r=0.9994）、1.98～39.60 μg/ml（r=0.9995）、3.10～62.00 μg/ml（r=0.9996）和2.28～45.60 μg/ml（r=0.9995），7種成分的平均加樣回收率（n=6）分別為99.6%、98.9%、98.7%、99.2%、98.2%、98.8%、98.2%，RSD分別為1.7%、1.0%、1.2%、1.5%、1.2%、1.2%、1.0%。結(jié)論 本方法結(jié)果準確，重現(xiàn)性好，回收率高，可用于黃芪護肝膠囊的質(zhì)量控制。

[關鍵詞]高效液相色譜法；黃芪護肝膠囊；延胡索乙素；芍藥苷；橙皮苷；五味子醇甲；丹參酮ⅡA；大黃素

[中圖分類號] R927.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）4（b）-0016-05

Simultaneous determination of 7 active components in Huangqi Hugan Capsules by high performance liquid chromatography

JI Guo-li LIU Bin▲

Tai′an Food and Drug Inspection and Testing Center，Shandong Province，Tai′an 271000，China

[Abstract]Objective To establish a high performance liquid chromatography （HPLC） method for simultaneous determination of main components of Tetrahydropalmatine，Paeoniflorin，Tanshinone ⅡA，Hesperidin，Emodin，Schisandrin A and Chrysophanol in Huangqi Hugan Capsules.Methods HPLC was used to detect the aforementioned components in Huangqi Hugan Capsules.The column was CNW Athena C18 and the mobile phase was methanol （A） and 0.1% aqueous solution of phosphoric acid （B） in gradient elution.The flow rate was 1.0 ml/min at 30℃ column temperature.The detection wavelength were 210 nm for Tetrahydropalmatine，230 nm for Paeoniflorin，Hesperidin and Schisandrin A，and 265 nm for Tanshinone ⅡA，Emodin，and Chrysophanol were 265 nm.The linear range，recovery，and repeatability of each component in Huangqi Hugan Capsules were examined.Results The linear ranges of Tetrahydropalmatine，Paeoniflorin，Hesperidin，Schisandrin A，Tanshinone ⅡA，Emodin and Chrysophanol were 1.26-25.20 μg/ml （r=0.9996），7.03-140.60 μg/ml （r=0.9998），3.63-72.60 μg/ml （r=0.9997），2.11-42.20 μg/ml （r=0.9994），1.98-39.60 μg/ml （r=0.9995），3.10-62.00 μg/ml （r=0.9996），and 2.28-45.60 μg/ml （r=0.9995）.The average recovery of 7 components （n=6） was 99.6%，98.9%，98.7%，99.2%，98.2%，98.8%，and 98.2%，respectively.RSD was 1.7%，1.0%，1.2%，1.5%，1.2%，1.2% and 1.0%，respectively.Conclusion The method is accurate and reproducible in a high recovery，which can be used for quality control of Huangqi Hugan Capsules.

[Key words]High performance liquid chromatography；Huangqi Hugan Capsules；Tetrahydropalmatine；Paeoniflorin；Hesperidin；Schisandrin A；Tanshinone Ⅱ A；Emodin

黃芪護肝膠囊是臨床常用的保肝藥物，是由多種中藥組成的復方制劑，其中包括赤芍、丹參、延胡索、大黃、陳皮等主要有效成分，用于慢性肝炎以及藥物性肝損傷等疾病的治療，其藥理作用復雜，如延胡索具有行氣、止痛、活血作用，其有效成分延胡索乙素具有鎮(zhèn)痛、催眠、降低冠脈阻力及增加血疫調(diào)節(jié)等作用[3]；五味子具有補腎寧心、抗衰老等作用[4]；丹參具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰止痛的作用；丹參酮ⅡA具有保護心血管、抗腫瘤、抗氧化等作用[5]；大黃具有利濕瀉下、清熱瀉火等作用[6]，黃芪護肝膠囊的藥理藥效與其中中藥組分的活性成分密切相關。本研究就黃芪護肝膠囊中延胡索、赤芍、五味子、陳皮以及丹參和大黃中的有效藥理成分含量的測定方法進行研究。

1儀器與試藥

1.1主要儀器

二極管陣列檢測器（SPD-M20A型，日本島津公司），高效液相色譜儀（LC-20AD型，日本島津公司），LC solution色譜工作站（日本島津公司），電子天平（十萬分之一級，瑞士梅特勒公司）。

1.2試藥

芍藥苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110736-201337），延胡索乙素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110726-201414），橙皮苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110721-201115），五味子醇甲對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110857-201211），自制黃芪護肝膠囊（批號為20141010、20140912、20141020）。大黃素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110756-200110），丹參酮ⅡA對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110766-200619），大黃酚對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110796-200716），其他試劑為分析純和純化水。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：CNW Athena C18（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B）采用梯度洗脫（0～10 min，A 33%；10～20 min，A 33%～65%；20～30 min，A 65%；30～35 min，A 65%～78%；35～50 min，A 78%；50～55 min，A 78%～85%；55～60 min，A 85%；60～70 min，A 85%～33%）；大黃素、丹參酮ⅡA、大黃酚檢測波長為265 nm；延胡索乙素檢測波長為210 nm，芍藥苷、五味子醇甲和橙皮苷檢測波長為230 nm，進樣量：10 μl，流速：1.0 ml/min，柱溫：30℃。延胡索乙素、大黃酚、芍藥苷、大黃素、橙皮苷、五味子醇甲、丹參酮ⅡA理論塔板數(shù)均≥5000，分離度均>1.5。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品儲備液和對照品溶液 精密稱取適量7種對照品，分別采用甲醇溶液制成質(zhì)量濃度為126、703、363、211、198、310、228 μg/ml的對照品儲備液備用。然后精密適量量取各種儲備液，加甲醇制成含延胡索乙素、芍藥苷、橙皮苷、五味子醇甲、丹參酮ⅡA、大黃素、大黃酚分別為12.6、70.3、72.6、42.2、19.8、31.0、22.8 μg/ml的混合對照品溶液。

2.2.2供試品溶液 黃芪護肝膠囊研磨成均勻細末，采用電子天平稱取粉末1 g，錐形瓶內(nèi)加入25 ml甲醇溶液及1 g黃芪護肝膠囊粉末，稱重后在功率頻率50 KHz、300 W條件下進行超聲震蕩處理30 min，冷卻后采用甲醛溶液補重，應用0.45 μm微孔濾膜進行過濾。

2.2.3陰性對照溶液 按照“2.2.1”中對照品溶液制備過程，分別制備不含有陳皮、延胡索、丹參、赤芍、延胡索和大黃單品的陰性對照溶液。

2.3空白試驗

適量供試品、對照品及陰性對照溶液注入LC-20AD型高效液相色譜儀，參數(shù)設置如下。進樣量：10 μl；流速：1.0 ml/min；柱溫：30℃。記錄色譜圖，分析檢測效果。結(jié)果顯示，供試品中延胡索乙素、五味子醇甲、橙皮苷、大黃素、大黃酚、芍藥苷、丹參酮ⅡA色譜峰保留時間與對照品一致，陰性對照溶液在相應對照品溶液相同保留時間處無干擾峰出現(xiàn)，提示黃芪護肝膠囊中延胡索、赤芍、五味子、陳皮以及丹參和大黃以外的其他中藥組分對測定結(jié)果無干擾。HPLC圖譜見圖1～8。

1.延胡索乙素；2.芍藥苷；3.橙皮苷；4.五味子醇甲；5.丹參酮ⅡA；6.大黃素；7.大黃酚

圖1 對照品HPLC色譜圖

1.延胡索乙素；2.芍藥苷；3.橙皮苷；4.五味子醇甲；5.丹參酮ⅡA；6.大黃素；7.大黃酚

圖2 樣品HPLC色譜圖

2.芍藥苷；3.橙皮苷；4.五味子醇甲；5.丹參酮ⅡA；6.大黃素；7.大黃酚

圖3 缺延胡索陰性對照樣品HPLC色譜圖

1.延胡索乙素；3.橙皮苷；4.五味子醇甲；5.丹參酮ⅡA；6.大黃素；7.大黃酚

圖4 缺赤芍陰性對照樣品HPLC色譜圖

1.延胡索乙素；2.芍藥苷；4.五味子醇甲；5.丹參酮ⅡA；6.大黃素；7.大黃酚

圖5 缺陳皮陰性對照樣品HPLC色譜圖

1.延胡索乙素；2.芍藥苷；3.橙皮苷；5.丹參酮ⅡA；6.大黃素；7.大黃酚

圖6 缺五味子陰性對照樣品HPLC色譜圖

1.延胡索乙素；2.芍藥苷；3.橙皮苷；4.五味子醇甲；6.大黃素；7.大黃酚

圖7 缺丹參陰性對照樣品HPLC色譜圖

1.延胡索乙素；2.芍藥苷；3.橙皮苷；4.五味子醇甲；5.丹參酮ⅡA

圖8 缺大黃陰性對照樣品HPLC色譜圖

2.4線性關系考察

分別精密吸取延胡索乙素、芍藥苷、大黃素、大黃酚橙皮苷、五味子醇甲、丹參酮ⅡA，對照品儲備液各0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 ml，加甲醇溶液稀釋至10 ml，配置成梯度濃度的混合對照品溶液，進樣量：10 μl，流速：1.0 ml/min，柱溫：30℃條件下分別進樣檢測，記錄色譜圖。以濃度C（μg/ml）對峰面積A進行線性回歸，延胡索乙素、芍藥苷、橙皮苷、五味子醇甲、丹參酮ⅡA、大黃素和大黃酚的回歸方程分別為：A=4.295×104C+1.374×103（r=0.9996）、A=3.547×104C+3.584×103（r=0.9998）、A=2.236×104C+3.750×103（r=0.9997）、A=6.140×104C+3.366×103（r=0.9994）、A=4.119×104C+2.794×103（r=0.9995）、A=2.155×104C+3.462×103（r=0.9996）和A=3.447×104C+1.863×103（r=0.9995）。橙皮苷、延胡索乙素、芍藥苷、丹參酮ⅡA、五味子醇甲、大黃酚、大黃素的線性范圍分別為3.63～72.60、1.26～25.20、7.03～140.60、1.98～39.60、2.11～42.20、2.28～45.60、3.10～62.00 μg/ml。

2.5精密度試驗

取混合對照品溶液，高效液相色譜儀進樣量：10 μl，流速：1.0 ml/min，柱溫：30℃，連續(xù)進樣6次，考察精密度。延胡索乙素、五味子醇甲、芍藥苷、丹參酮ⅡA、橙皮苷、大黃素和大黃酚峰面積的RSD分別為0.5%、0.6%、0.4%、0.7%、0.6%、0.5%和0.8%。

2.6重復性實驗

按“2.2.2”項下，平行制備同一樣品（批號：20140912）6份，依法進行測定，并分別計算含量，延胡索乙素、芍藥苷、橙皮苷、五味子醇甲、丹參酮ⅡA、大黃素和大黃酚的RSD分別為1.0%、0.6%、1.1%、0.8%、0.7%、1.0%和1.1%。

2.7穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液分別在0、2、4、6、8、10、12 h依次進行測定，延胡索乙素、芍藥苷、五味子醇甲、橙皮苷、丹參酮ⅡA、大黃素和大黃酚峰面積的RSD分別為0.8%、0.6%、0.8%、0.7%、1.0%、1.0%和1.2%。

2.8回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品（批號：20140912）0.5g，共6份，分別精密加入延胡索乙素、芍藥苷、橙皮苷、五味子醇甲、丹參酮ⅡA、大黃素和大黃酚峰對照品貯備液1.0 ml，按照“2.2.2”步驟制成供試液，依次進行加樣測定，計算各樣品回收率，結(jié)果見表1。

2.9樣品測定

取3批黃芪護肝膠囊樣品，按“2.2.2”步驟配制供試品溶液，進樣量：10 μl，流速：1.0 ml/min，柱溫：30℃進樣檢測，記錄色譜圖，用外標法分別計算樣品中延胡索乙素、五味子醇甲、芍藥苷、丹參酮ⅡA、橙皮苷、大黃素、大黃酚含量（表2）。

3討論

3.1檢測波長的選擇

黃芪護肝膠囊是中藥復方制劑，其中主要的重要組分有18種，赤芍、丹參、延胡索、大黃、陳皮等是主要的藥效成分，其中活性成分的含量對藥理藥效的發(fā)揮具有重要作用，而對于其中主要藥理成分的檢測是進行質(zhì)控的方法之一，其中延胡索乙素、芍藥苷、丹參酮ⅡA、橙皮苷、大黃素、五味子醇甲、大黃酚等是具有活性的主要藥理成分。為了能夠同時對其采用高效液相色譜法進行檢測，選擇能夠適合多種組分的檢測波長具有重要作用，如橙皮苷在207 nm和283 nm具有特征性的吸收峰，而在波長230 nm時候延胡索乙素的吸收峰最強，在217 nm波長條件下五味子醇甲的吸收峰最大，而在230 nm波長時五味子醇甲的吸收峰也較強，而且分離度好，靈敏度高，能夠取得較好的檢測效果，因此以上幾種成分檢測過程中采用230 nm作為共同的檢測波長能夠取得較為理想的效果。丹參酮ⅡA在224 nm和268 nm波長處有特征吸收，大黃素在222 nm波長處有最大吸收，且在252、265、289 nm波長處有特征吸收，225 nm和256 nm波長處大黃酚均具有特征性的吸收峰，但265 nm波長處大黃酚也有較強吸收，而且檢測效果穩(wěn)定，靈敏度高，分離度好，無基線飄移，能夠取得較好的檢測效果，因此對于丹參酮ⅡA、大黃酚和大黃素的共同檢測波長確定為265 nm。

3.2流動相的選擇

既往的文獻研究顯示[7-15]，甲醇-磷酸鹽溶液、甲醇-水溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液及甲醇-0.1%磷酸溶液在檢測過程中均可作為流動相。研究結(jié)果顯示，以甲醇-0.1%磷酸溶液為流動相能夠取得較好的分離效果，檢測物的吸收峰對稱且較為尖銳，吸收峰的形態(tài)較為理想，理論搭板數(shù)更高。黃芪護肝膠囊中的成分較為復雜，檢測物質(zhì)的性狀存在較大的差別[16-20]，為了獲取較好的檢測效果，使各檢測物的色譜峰分離度更好，出峰時間更合理，通過梯度洗脫的方法，對甲醇和0.1%磷酸溶液配比的不斷調(diào)整，對載液的極性、離子強度等不斷優(yōu)化，使得檢測物質(zhì)均能獲得良好的吸收峰，而且無雜質(zhì)峰形成及干擾，獲得較好的效果。

3.3供試品溶液制備方法的選擇

為了考察不同溶劑以及不同方法提取效果，分別采用超聲提取和回流提取，并且在提取過程中采用70%甲醇溶液、乙醇溶液和甲醇溶液作為溶劑進行考察，結(jié)果顯示延胡索乙素、芍藥苷、橙皮苷、五味子醇甲、丹參酮ⅡA、大黃素和大黃酚等7種檢測物在甲醇溶液中較為穩(wěn)定，雜質(zhì)干擾小，提取效果較好，對不同的提取技術進行比較發(fā)現(xiàn)，超聲提取的效果比回流提取的效果要好，采用甲醇為溶液、采用超聲提取30 min能夠獲得最好的提取效果。綜合評定，采用本研究中的方法測定黃芪護肝膠囊中的7種有效成分重復性好，回收率高，結(jié)果準確，而且操作簡便，適宜于在黃芪護肝膠囊的質(zhì)量控制中使用。

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（收稿日期：2018-01-15 本文編輯：祁海文）