山慈菇水煎劑對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響

林曉燕 孫曉紅 張璐萍

【摘要】目的：研究山慈菇水煎劑對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響。方法：山慈菇水煎劑（200，400，600mg/mL）分別作用于膠質(zhì)瘤U118細(xì)胞0h、24h、48h，分別采用CCK-8實驗、劃痕實驗、Transwel1實驗對細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力進行檢測。結(jié)果：山慈菇水煎劑（200，400，600mg/mL）作用于膠質(zhì)瘤U118細(xì)胞24小時和48小時均能顯著降低細(xì)胞的增殖能力（P<0.05），且當(dāng)山慈菇水煎劑（200，400，600mg/mL）作用于U118細(xì)胞48小時，增殖抑制率分別高達20.64%、47.61%、51.23%；劃痕實驗結(jié)果表明，不同濃度山慈菇水煎劑作用24小時及48小時均能明顯降低膠質(zhì)瘤U118細(xì)胞的遷移能力（P<0.05），且48小時藥物降低細(xì)胞遷移的能力高于24小時；體外侵襲實驗顯示，山慈菇水煎劑（200，400，600mg/mL）培養(yǎng)24h和48h均能明顯的降低侵襲細(xì)胞數(shù)目，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；結(jié)論：山慈菇水煎劑能夠減輕U118膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，但對于其具體的機制還需要進一步的研究。

【關(guān)鍵詞】山慈菇水煎劑；膠質(zhì)瘤細(xì)胞；增殖；侵襲；遷移

膠質(zhì)瘤是一種發(fā)病率高、致死率高的惡性腦腫瘤，5年內(nèi)腦膠質(zhì)瘤患者的生存率小于10%，該病多發(fā)于30歲至40歲的中年人群，其約占中年顱內(nèi)腫瘤患者的1/3至2/3。膠質(zhì)瘤侵襲性高，發(fā)病機制復(fù)雜，對于該疾病還沒有完全根治的治療方法[1]。目前，對于腦膠質(zhì)瘤的治療，臨床上主要采用手術(shù)配合術(shù)后放化療為主。放化療不僅對腫瘤細(xì)胞存在殺傷力，對機體內(nèi)正常的細(xì)胞也有很強的殺傷力[2]，副作用強，加重患者的不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量及生活質(zhì)量[3-5]。山慈菇是常用的抗腫瘤中藥之一，有解毒消腫的功效，用于癰疽惡瘡、淋巴結(jié)核和蛇蟲咬傷的作用?，F(xiàn)代藥理研究表明，山慈菇具有抗腫瘤細(xì)胞生長、抑制血管生成、抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移、抗炎等作用。本課題采用山慈菇水煎劑作用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞，研究其對該細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響，以期為腦膠質(zhì)瘤靶向治療藥物的研究提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物及制備

U118膠質(zhì)瘤細(xì)胞株由上海復(fù)旦大學(xué)細(xì)胞庫提供，山慈菇購自北京同仁堂藥店。電子精密天平秤取100g山慈菇藥材，根據(jù)傳統(tǒng)中藥煎煮方法進行煎煮。待液體至100mL附近時將其轉(zhuǎn)移至高壓滅菌后的燒杯中，并使用無菌培養(yǎng)皿將盛有煎劑的燒杯蓋住，濃縮煎劑至50mL。于超凈工作臺中將水煎劑加入離心管（經(jīng)高壓滅菌處理）中，離心5min，轉(zhuǎn)速為1000r.min-1，取上清。取5μL上清加入1mL無菌DMEM培養(yǎng)基中，置于3712，5%c02培養(yǎng)箱中放置48h，觀察水煎劑是否染菌。剩余上清密封于4℃保存?zhèn)溆谩?8h培養(yǎng)后的上清置于顯微鏡下觀察，確認(rèn)無菌后，此次制備的水煎劑上清（2kg·L-1）原液即可用于后續(xù)的實驗中。根據(jù)實驗所需要的水煎劑濃度加入培養(yǎng)基，在超凈臺中，無菌條件下，稀釋至研究所需要的濃度。

1.2 儀器與試劑

CCK-8試劑、碘化丙啶（PI）試劑、DMSO試劑、DAPI試劑、RNA酶、生理鹽水和無水乙醇購于Sigma公司；胰蛋白酶購于Hyclone公司；胎牛血清（FetalBovine Serum，F(xiàn)BS）、DMEM高糖培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；Transwell小室購于美國Coming公司；Matrigel基底膜購于美國BD公司；多功能酶標(biāo)儀購于美國Mo-lecular Devices公司；倒置顯微鏡購于日本OLYMPUS公司，CO2培養(yǎng)箱購于德國BINDER公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購于美國Forma Scientific公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)

人膠質(zhì)瘤U118細(xì)胞采用含10%FBS（已滅活）的高糖DIVIEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，將細(xì)胞置于3712、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，依據(jù)細(xì)胞具體生長狀況，帶其長滿培養(yǎng)瓶70%～80%時對其進行傳代處理，周期約為2天到3天，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實驗研究。

1.3.2 CCK-8實驗

細(xì)胞增殖情況采用CCK-8方法進行檢測。取對數(shù)生長期U118細(xì)胞，以1×104個細(xì)胞每孔接種于96孔板中，置于3712、5%CO2培養(yǎng)箱中過夜，待其貼壁后加入山慈菇水煎劑（200mg/mL，400mg/mL，600mg/mL）培養(yǎng)24h：另外同樣分組，山慈菇水煎劑（200mg/mL，400mg/mL，600mg/mL）作用于細(xì)胞48h。待藥物作用時間足夠，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗兩遍，吸凈PBS洗滌液，加入10μL CCK-8試劑，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4h，450nm波長處酶標(biāo)儀測定各孔光吸收值（OD值）。每組實驗重復(fù)3次，記錄數(shù)據(jù)用于后期統(tǒng)計。增值抑制率（%）=[（對照組OD值.加藥組OD值）/對照組OD值]×100%。

1.3.3 劃痕實驗

將U118膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種于無菌6孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為2×106個，置于培養(yǎng)箱中，待過夜細(xì)胞貼壁后，使用200μL的槍頭劃出一條直的劃痕，使用PBS將劃下來的細(xì)胞洗滌干凈，加入無血清DIVIEM培養(yǎng)基，分別加入山慈菇水煎劑（200mg/mL，400mg/mL，600mg/mL）培養(yǎng)oh，24h，48h在顯微鏡下觀察，并拍照記錄，本實驗重復(fù)三次，統(tǒng)計分析山慈菇水煎劑對U118細(xì)胞遷移的影響。

1.3.4 體外侵襲實驗

在Trenswell小室（孔徑8pm）上室的底膜表面鋪上40μL Matrigel膠，稀釋比例為1：3，37℃孵育0.5h。用無血清DMEM培養(yǎng)液稀釋對數(shù)生長期U118細(xì)胞，上室中加入100μL細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)2×104個，Transwell小室下室中加入500μL DMEM（含10%FBS）培養(yǎng)液，恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜細(xì)胞貼壁后；分別加入山慈菇水煎劑（200mg/mL，400mg/mL，600mg/mL）培養(yǎng)Oh，24h，48h，棄去上室培養(yǎng)液，加入甲醇固定0.5h，0.1%結(jié)晶紫染色20mln，在顯微鏡下觀察，細(xì)胞計數(shù)，并拍照記錄。實驗重復(fù)3次，用于后期統(tǒng)計分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

上述實驗均需重復(fù)三次，實驗獲得的數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（'x±s）表示。數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析，當(dāng)P<0.05時，差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 山慈菇水煎劑對U118膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響

與對照組相比，加入山慈菇水煎劑不同濃度200mg/mL、400mg/mL、600mg/mL培養(yǎng)24h后，U118細(xì)胞增殖抑制率分別為12.51%、12.72%、39.28%，24h山慈菇水煎劑作用后細(xì)胞的增殖抑制率均明顯的高于對照組，差異顯著具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與對照組相比，加入山慈菇水煎劑不同濃度200mg/mL、400mg/mL、600mg/mL培養(yǎng)48h后，U118細(xì)胞增殖抑制率分別為20.64%、47.61%、51.23%，48h山慈菇水煎劑作用后細(xì)胞的增殖抑制率均明顯的高于對照組，差異顯著具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），如圖l所示。

2.2 山慈菇水煎劑對U118膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的影響

對照組U118膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)24小時，細(xì)胞遷移至劃痕的中間部分，加入山慈菇水煎劑不同濃度200mg/mL、400mg/mL、600mg/mL培養(yǎng)24h后，相對劃痕面積分別為41.12%，68.33%，78.32%，24h山慈菇水煎劑作用后細(xì)胞劃痕面積均明顯的高于對照組，差異顯著具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；對照組U118膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)48小時后，加入山慈菇水煎劑不同濃度200mg/mL、400mg/mL、600mg/mL培養(yǎng)48h后，相對劃痕面積分別為30.12%，42.20%，64.21%，48h山慈菇水煎劑作用后細(xì)胞劃痕面積明顯的高于對照組，差異顯著具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），如圖2所示。

2.3 山慈菇水煎劑對U118膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲的影響

由表1可以看出，加入山慈菇水煎劑不同濃度200mg/mL、400mg/mL、600mg/mL培養(yǎng)24h后，侵襲細(xì)胞數(shù)目均明顯的少于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；加入山慈菇水煎劑不同濃度200mg/mL、400mg/mL、600mg/mL培養(yǎng)48h后，侵襲細(xì)胞數(shù)目均明顯的少于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；此外，研究還發(fā)現(xiàn)，山慈菇水煎劑不同濃度200mg/mL、400mg/mL、600mg/mL作用于U118膠質(zhì)瘤細(xì)胞48h侵襲數(shù)目明顯的少于24h，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

中醫(yī)中腫瘤主要歸于“積聚”“痰核”范疇中，其發(fā)病可能與癌毒、痰凝、血瘀等相關(guān)。痰是構(gòu)成腫瘤組織的有形成分之一，因其膠著黏膩之。山慈菇具有散結(jié)及化痰的作用，因此考慮其可能對于癌癥具有治療作用，且前期的多項研究表明，山慈菇具有抗腫瘤的藥理作用，但是對于其具體的機制尚不明確[6]。

本研究結(jié)果顯示，山慈菇水煎劑200mg/mL、400mg/mL、600mg/mL培養(yǎng)24h后，U118細(xì)胞增殖抑制率分別為12.51%、12.72%、39.28%，其對細(xì)胞的增殖抑制率明顯的高于對照組；培養(yǎng)48h后，加藥組U118細(xì)胞增殖抑制率分別為20.64%、47.61%、51.23%，山慈菇水煎劑作用后細(xì)胞的增殖抑制率明顯的高于藥物作用24h時。加入山慈菇水煎劑不同濃度200mg/mL、400mg/mL、600mg/mL培養(yǎng)24h后，相對劃痕面積分別為41.12%，68.33%，78.32%，細(xì)胞的遷移能力均明顯的低于對照組：對照組U118膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)48小時后，相對劃痕面積分別為30.12%，42.20%，64.21%，48h山慈菇水煎劑作用后細(xì)胞遷移能力均明顯的低于細(xì)胞培養(yǎng)24h時。

加入山慈菇水煎劑不同濃度200mg/mL、400mg/mL、600mg/mL培養(yǎng)24h后，侵襲細(xì)胞數(shù)目均明顯的少于對照組：加入山慈菇水煎劑不同濃度200mg/mL、400mg/mL、600mg/mL培養(yǎng)48h后，侵襲細(xì)胞數(shù)目均明顯的少于對照組；此外，研究還發(fā)現(xiàn)，山慈菇水煎劑不同濃度200mg/mL、400mg/mL、600mg/mL作用于U118膠質(zhì)瘤細(xì)胞48h侵襲數(shù)目明顯的少于24h。

綜上所述，山慈菇水煎劑200mg/mL、400mg/mL、600mg/mL作用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞24小時和48小時均能降低細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，且隨著作用時間的延長，藥物濃度的增加，藥物的抗增殖、侵襲和遷移的能力均增加，對于具體的機制，還需進一步的研究。

參考文獻

[1]郭淳，龔永杰，孫放等.山慈菇水煎劑對人乳腺癌T-47D細(xì)胞增殖和遷移的影響[J].中醫(yī)學(xué)報，2017，32（10）：1832—1835.