胡瑞陽 孫宇涵 吳博 段紅靜 林華忠 方祿明 余小龍 李云
(北京林業(yè)大學(xué),北京,100083) (福建省將樂國有林場) (北京林業(yè)大學(xué))
杉木(Cunninghamialanceolata(Lamb.) Hook)是我國重要的人工用材林造林樹種,栽培歷史悠久,分布區(qū)域廣,一直是我國林木遺傳改良工作的主要研究對(duì)象[1-2]?;瘜W(xué)誘變育種借助具有誘變作用的化學(xué)物質(zhì)誘發(fā)植物的基因突變,可顯著提高誘變材料的突變頻率,是改變林木不良性狀以及選育新種質(zhì)的有效育種手段[3]。化學(xué)誘變具有隨機(jī)性,因此,杉木誘變處理后可創(chuàng)造豐富的變異,獲得大量種質(zhì)遺傳材料,為杉木新種質(zhì)的篩選奠定基礎(chǔ)[4]。
疊氮化鈉(NaN3)是一種能夠高效制造點(diǎn)突變的化學(xué)誘變劑,其作用機(jī)理是在酸性條件下NaN3產(chǎn)生呈中性的分子HN3,HN3易透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),進(jìn)而以堿基替換方式影響DNA的正常合成,從而導(dǎo)致點(diǎn)突變的產(chǎn)生[5-6]。目前,NaN3已廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物和花卉,影響植物材料的生長發(fā)育,誘發(fā)植株表型發(fā)生明顯變異。如NaN3處理顯著降低小麥、大豆種子的發(fā)芽率和植株成活率,并誘導(dǎo)小麥葉色、穗型、育性、莖干高矮等表型發(fā)生多種類型的變異[7-8],增加大豆誘變苗株高、主莖節(jié)數(shù)、分枝數(shù)等的變異范圍[9];NaN3處理還影響玉米、番茄、玉扇愈傷組織的增殖及再生[10-12],抑制文心蘭類原球莖及再生苗生長[13],誘導(dǎo)玉扇愈傷組織再生芽葉色、株型和葉序變異[12]。
NaN3應(yīng)用于林木誘變的研究較少,但已被證實(shí)可以抑制青檀幼苗的成活[14],誘導(dǎo)巨尾桉產(chǎn)生能夠抵御寒脅迫的突變[15]。杉木NaN3化學(xué)誘變的研究表明,NaN3誘變處理可以誘導(dǎo)杉木幼苗葉片白化[16]。前期在以杉木種子為供試材料時(shí)發(fā)現(xiàn)NaN3影響種子成苗及幼苗生長[4,17],但NaN3濃度及誘變處理時(shí)間對(duì)杉木種子萌發(fā)以及萌發(fā)后幼苗生長造成什么樣的影響,需要進(jìn)一步試驗(yàn)分析。因此,本研究選擇杉木第3代種子園采集的良種為供試材料,經(jīng)NaN3誘變處理,研究不同NaN3濃度及處理時(shí)間對(duì)發(fā)芽率、發(fā)芽時(shí)間以及誘變苗早期生長的影響,旨在為開展杉木NaN3誘變育種研究提供技術(shù)支持。
以3代杉木種子園所產(chǎn)良種為本研究的供試材料。2011年11月份于福建省將樂縣國有林場3代種子園采集杉木成熟球果,收集晾曬散出的種子于4 ℃低溫冷藏備用。經(jīng)測(cè)定,供試杉木干種子的平均質(zhì)量為5.93 mg·粒-1。
2012年2月份取低溫冷藏的種子,室溫25 ℃避光條件下,首先將杉木干種子浸泡在蒸餾水中4 d,每1 d換水1次,浸泡完成后的種子用蒸餾水清洗3次,然后再進(jìn)行NaN3誘變處理。誘變?cè)囼?yàn)設(shè)置6個(gè)NaN3濃度梯度(0、2、4、6、8、10 mmol·L-1)、3個(gè)處理時(shí)間(4、8、12 h),各濃度的NaN3溶液用pH=3.0、0.1 mol·L-1的磷酸緩沖液配制。誘變處理時(shí),將蒸餾水浸泡后的杉木種子完全浸入到各濃度的NaN3溶液中,室溫25 ℃避光條件下分別振蕩(120 r·min-1)處理4、8、12 h,蒸餾水清洗5次去除種子表面殘留NaN3溶液后進(jìn)行誘變種子發(fā)芽及誘變苗培育試驗(yàn)。各NaN3溶液濃度與處理時(shí)間組合的參試種子數(shù)量為2 100粒,并設(shè)置3次重復(fù),其中100粒用于誘變種子發(fā)芽,2 000粒用于誘變苗培育。
誘變種子發(fā)芽:杉木種子經(jīng)NaN3誘變處理后,播種到以水苔為培養(yǎng)基質(zhì)的培養(yǎng)皿中進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。杉木種子發(fā)芽試驗(yàn)參照胡瑞陽等[18]的試驗(yàn)方法,在人工氣候室內(nèi)進(jìn)行,70%相對(duì)濕度,25 ℃ 16 h光照與20 ℃ 8 h黑暗交替,光照強(qiáng)度為200~250 μmol·m-2·s-1。每天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽種子的數(shù)量,待發(fā)芽完成后計(jì)算起始發(fā)芽時(shí)間、發(fā)芽持續(xù)時(shí)間、發(fā)芽時(shí)間和發(fā)芽率。
誘變苗培育:杉木種子經(jīng)NaN3誘變處理后,直接按照完全隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)條播于福建省將樂縣國有林場育苗圃實(shí)驗(yàn)區(qū)進(jìn)行誘變苗培育。9個(gè)月后,從誘變苗群體中隨機(jī)選取150株誘變苗測(cè)量苗高、地徑和側(cè)枝數(shù),并統(tǒng)計(jì)各指標(biāo)的最大值和最小值,計(jì)算變異幅度。除10 mmol·L-1-12 h處理組合的少量誘變苗全部死亡外,其余濃度時(shí)間組合均得到了大量正常生長的誘變苗,完全能夠滿足誘變苗調(diào)查數(shù)量要求。
起始發(fā)芽時(shí)間=發(fā)芽試驗(yàn)開始到種子開始發(fā)芽所需時(shí)間;
發(fā)芽持續(xù)時(shí)間=種子開始發(fā)芽到發(fā)芽完成所需時(shí)間;
發(fā)芽時(shí)間=起始發(fā)芽時(shí)間+發(fā)芽持續(xù)時(shí)間;
發(fā)芽率=(發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%;
變異幅度=最大值-最小值。
利用Excel 2010和DPS V7.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。其中,種子發(fā)芽、誘變苗早起長勢(shì)等數(shù)據(jù)均通過標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行方差分析,在置信水平95%上用Duncan法(p<0.05)進(jìn)行多重比較。
從表1、表2可以看出,NaN3誘變劑濃度及處理時(shí)間均會(huì)顯著影響杉木種子的發(fā)芽。對(duì)照中蒸餾水浸泡4~12 h的杉木種子在水苔為培養(yǎng)基質(zhì)的培養(yǎng)皿中第2天便可開始發(fā)芽,起始發(fā)芽時(shí)間為0 d。2~10 mmol·L-1的NaN3溶液浸泡處理會(huì)延長杉木種子起始發(fā)芽時(shí)間,且時(shí)間隨著濃度的增加而顯著延長,當(dāng)NaN3濃度達(dá)到最大的10 mmol·L-1時(shí),平均起始發(fā)芽時(shí)間最長,為9.56 d(表1)。杉木種子的起始發(fā)芽時(shí)間同樣會(huì)隨著誘變處理時(shí)間的增加而延長,誘變處理4 h時(shí)平均起始發(fā)芽時(shí)間為2.17 d,處理時(shí)間增加到12 h則平均起始發(fā)芽時(shí)間顯著延長到6.56 d(表2)。對(duì)照中蒸餾水浸泡的杉木種子平均12.56 d便可發(fā)芽完成,2~10 mmol·L-1的NaN3誘變處理均顯著增加了發(fā)芽持續(xù)時(shí)間,但不同于起始發(fā)芽時(shí)間,隨著NaN3濃度的增加,發(fā)芽持續(xù)時(shí)間呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)(表1)。誘變處理時(shí)間對(duì)發(fā)芽持續(xù)時(shí)間的影響與NaN3濃度類似,8 h處理時(shí)的發(fā)芽持續(xù)時(shí)間最長達(dá)到了20.17 d(表2)。從發(fā)芽試驗(yàn)開始到發(fā)芽完成,杉木種子發(fā)芽所需發(fā)芽時(shí)間為12.56 d,NaN3溶液處理顯著增加了發(fā)芽時(shí)間,且隨著濃度增加發(fā)芽時(shí)間逐漸延長,濃度達(dá)到最大的10 mmol·L-1時(shí),杉木種子發(fā)芽完成所需時(shí)間延長了1倍(表1)。4~12 h的NaN3處理同樣延長了杉木種子發(fā)芽時(shí)間,但8 h處理所需發(fā)芽時(shí)間最長,為23.78 d(表2)。與發(fā)芽時(shí)間相反,NaN3誘變處理顯著降低了杉木種子發(fā)芽率。NaN3溶液濃度在2~10 mmol·L-1范圍內(nèi),濃度越高發(fā)芽率越低,尤其是NaN3濃度從8到10 mmol·L-1時(shí),發(fā)芽率從25.89%降低到12.11%,相比對(duì)照40.89%的發(fā)芽率降低了一半(表1),因此,結(jié)合半致死劑量原則,NaN3誘變處理杉木種子4~12 h時(shí),最適宜的濃度為8~10 mmol·L-1。
表1 不同NaN3濃度對(duì)杉木種子發(fā)芽及誘變苗早期長勢(shì)的影響
注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;同列不同字母表示在0.05水平差異顯著。
表2 不同處理時(shí)間對(duì)杉木種子發(fā)芽及誘變苗早期長勢(shì)的影響
注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;同列不同字母表示在0.05水平差異顯著。
不同的NaN3誘變劑濃度與處理時(shí)間組合同樣顯著影響杉木種子的發(fā)芽(表3)。對(duì)照試驗(yàn)中,4~12 h處理的杉木種子起始發(fā)芽時(shí)間全部為0 d,發(fā)芽持續(xù)時(shí)間、發(fā)芽時(shí)間與發(fā)芽率有差異,但不顯著。NaN3誘變處理后杉木種子,隨著NaN3濃度增加以及處理時(shí)間的延長,起始發(fā)芽時(shí)間顯著延長;表現(xiàn)在NaN3濃度越大誘變處理時(shí)間越長,所需的起始發(fā)芽時(shí)間越長,NaN3濃度為10 mmol·L-1、處理時(shí)間為12 h時(shí),杉木種子起始發(fā)芽所需時(shí)間平均達(dá)到了15 d。同一誘變處理時(shí)間,發(fā)芽持續(xù)時(shí)間隨著NaN3濃度增加呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì);同一NaN3濃度,4~12 h處理的杉木種子所需發(fā)芽持續(xù)時(shí)間均是在8 h達(dá)到最大值。杉木種子經(jīng)4~12 h誘變處理,所需的發(fā)芽時(shí)間均隨著NaN3濃度的增加而呈現(xiàn)先升高后降低再升高的趨勢(shì),并且均是在NaN3濃度為10 mmol·L-1時(shí)達(dá)到最大值。同一誘變處理時(shí)間,種子發(fā)芽率與NaN3濃度呈負(fù)相關(guān),表現(xiàn)在NaN3濃度越大、處理時(shí)間越長,發(fā)芽率越低;同一NaN3濃度誘變處理中,隨著處理時(shí)間的延長,對(duì)照的種子發(fā)芽率則逐漸增加,當(dāng)濃度為2~8 mmol·L-1時(shí)種子發(fā)芽率呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì),并在8 h達(dá)到最大值,當(dāng)濃度達(dá)到10 mmol·L-1時(shí)種子發(fā)芽率則顯著降低。如表1和表2所示,依據(jù)半致死劑量原則NaN3誘變處理杉木種子4~12 h時(shí),最適宜的濃度為8~10 mmol·L-1。表3研究結(jié)果表明,NaN3濃度達(dá)到最大的10 mmol·L-1、處理時(shí)間為12 h時(shí),發(fā)芽率僅為3%,接近致死狀態(tài),處理時(shí)間降為4 h時(shí)發(fā)芽率為19.67%,是其對(duì)照發(fā)芽率(37.33%)的52.69%,已經(jīng)非常接近半致死率;當(dāng)NaN3濃度為8 mmol·L-1時(shí),經(jīng)4~12 h的誘變處理后杉木種子發(fā)芽率分別為25.00%、28.00%和24.67%,分別是其對(duì)照發(fā)芽率的66.97%、68.85%和55.22%,可知,處理時(shí)間為12 h時(shí)最接近半致死率;因此,綜合表1、表2和表3,依據(jù)半致死劑量原則,本研究確定NaN3誘變處理杉木種子的適宜條件為10 mmol·L-1處理4 h或8 mmol·L-1處理12 h。
從表1和表2可看出,未經(jīng)誘變處理的杉木種子培育9個(gè)月后,獲得對(duì)照苗的平均株高為19.73 cm、地徑2.78 mm、側(cè)枝0.94個(gè)。2~10 mmol·L-1的NaN3誘變處理顯著抑制了誘變苗生長,表現(xiàn)在NaN3濃度越大,株高越矮、地徑越細(xì);8 mmol·L-1的NaN3誘變處理獲得的誘變苗平均株高和地徑分別為13.91 cm和2.57 mm,相比對(duì)照分別降低了30%和8%;當(dāng)NaN3濃度達(dá)到最大時(shí),平均株高和地徑分別降低到11.95 cm和2.03 mm,相比對(duì)照分別降低了40%和27%。4 mmol·L-1的NaN3誘變處理會(huì)顯著降低了誘變苗群體的側(cè)枝數(shù)量;NaN3其他濃度處理中,2、6 mmol·L-1的誘變處理增加了側(cè)枝數(shù),8、10 mmol·L-1的誘變處理減少了側(cè)枝數(shù),但相比對(duì)照差異不顯著。3個(gè)誘變處理時(shí)間均顯著影響了誘變苗群體的株高、地徑和側(cè)枝數(shù),并且這3個(gè)表型指標(biāo)均是在8 h誘變處理時(shí)達(dá)到最大值。
表3 NaN3濃度與處理時(shí)間組合對(duì)杉木種子發(fā)芽的影響
注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;同列不同字母表示在0.05水平差異顯著。
不同NaN3誘變劑濃度與處理時(shí)間組合同樣顯著影響杉木誘變苗群體的株高、地徑和側(cè)枝數(shù)(表4)。4 h誘變處理中,2 mmol·L-1低濃度NaN3溶液處理將誘變苗株高降低到18.87 cm,相比對(duì)照的19.47 cm差異不顯著,但誘變處理明顯增加了株高的變異幅度;4~8 mmol·L-1較高濃度處理則顯著降低誘變苗的株高;當(dāng)濃度達(dá)到10 mmol·L-1時(shí),相比較低濃度(4~8 mmol·L-1)株高有顯著增加但平均高度仍顯著低于對(duì)照。誘變處理時(shí)間延長到8~12 h時(shí),誘變苗株高的變化規(guī)律與4 h相似,即NaN3溶液濃度為2~8 mmol·L-1時(shí),濃度越高對(duì)株高的抑制作用越明顯;8 h誘變處理中,NaN3濃度為10 mmol·L-1時(shí)獲得的誘變苗株高為18.38 cm顯著高于2~8 mmol·L-1,但仍低于對(duì)照的24.29 cm;杉木種子經(jīng)10 mmol·L-1的NaN3處理12 h后,在人工氣候室內(nèi)進(jìn)行的發(fā)芽試驗(yàn)中雖然有3.00%的種子發(fā)芽率(表3),但播種于育苗圃后9個(gè)月的生長期內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)長出圃地的誘變苗存在,故此誘變處理組合沒有株高、地徑和側(cè)枝的測(cè)量數(shù)據(jù)。相比對(duì)照,雖然4 h的誘變處理對(duì)誘變苗地徑差異不明顯,但較低濃度(2~6 mmol·L-1)的NaN3處理明顯增加了誘變苗地徑的變異幅度。8 h處理中,隨著NaN3溶液濃度的增加,誘變苗地徑均值逐漸增大,并且當(dāng)濃度達(dá)到最大的10 mmol·L-1時(shí)地徑均值達(dá)到了3.39 mm,已經(jīng)超過對(duì)照的3.18 mm。12 h誘變處理對(duì)地徑影響差異不顯著,但2~8 mmol·L-1的NaN3處理明顯擴(kuò)大了誘變苗地徑的變異幅度。4 mmol·L-1的NaN3溶液處理杉木種子4~8 h顯著減少誘變苗的側(cè)枝數(shù),平均為0.57~0.67個(gè);10 mmol·L-1的NaN3溶液處理8 h顯著增加了誘變苗的側(cè)枝數(shù),平均達(dá)到了1.65個(gè),并且側(cè)枝數(shù)的變異幅度也達(dá)到了最大值7。
NaN3誘變處理會(huì)影響植物材料的生長發(fā)育,并誘導(dǎo)植株表型發(fā)生明顯變異[19]。5~20 mmol·L-1的NaN3處理小麥種子2 h會(huì)顯著抑制種子萌發(fā)活動(dòng),降低發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率[7]。本研究同樣發(fā)現(xiàn),NaN3誘變處理顯著抑制杉木種子萌發(fā),表現(xiàn)在延長發(fā)芽所需時(shí)間,且這種延遲效果與NaN3濃度和處理時(shí)間呈正相關(guān)。NaN3對(duì)種子的誘變效應(yīng)不只表現(xiàn)在種子發(fā)芽階段,還會(huì)持續(xù)到種子萌發(fā)后的幼苗生長發(fā)育階段。如0.04%的NaN3溶液浸泡大豆種子12 h所得M1代植株出現(xiàn)矮化和晚熟現(xiàn)象,且株高、分枝數(shù)、粒質(zhì)量等表型指標(biāo)的變異范圍明顯增加[9]。本研究中,NaN3處理不僅降低了種子發(fā)芽率、延長了杉木種子的發(fā)芽時(shí)間,而且抑制了誘變苗的生長,造成株高矮化和莖粗變細(xì),誘變苗群體之間變異幅度差異增大。類似航天誘變、伽馬射線對(duì)植物材料生長發(fā)育的影響[20-21],NaN3誘變處理能夠誘導(dǎo)苜蓿愈傷組織以及蝴蝶蘭類原球莖發(fā)生生理損傷,如導(dǎo)致脯氨酸、丙二醛、可溶性糖、過氧化氫酶等生理生化指標(biāo)發(fā)生顯著變化[22-23],NaN3還能夠降低玉米愈傷組織的代謝水平[24],造成大麥萌發(fā)胚的DNA損傷[25]。NaN3誘導(dǎo)植物材料內(nèi)部生理、代謝以及DNA水平上的變化很有可能是造成杉木種子發(fā)芽延遲、誘變苗生長發(fā)育受阻、變異幅度增加的部分原因。
表4 不同NaN3濃度與處理時(shí)間組合對(duì)杉木誘變苗株高、地徑和側(cè)枝的影響
注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;同列不同字母表示在0.05水平差異顯著;“-”表示無測(cè)量數(shù)據(jù)。
選擇適宜的誘變劑濃度及處理時(shí)間是植物化學(xué)誘變成功的關(guān)鍵因素之一[26-28]。誘變處理時(shí),一般以材料的半致死率作為適宜誘變劑量及處理時(shí)間的篩選標(biāo)準(zhǔn),這既可以保證材料有較高的突變率,又不致過分損傷而導(dǎo)致試驗(yàn)材料死亡[29]。本研究發(fā)現(xiàn),NaN3溶液濃度越高對(duì)杉木種子造成的傷害越嚴(yán)重,表現(xiàn)在發(fā)芽時(shí)間顯著延長、發(fā)芽率顯著降低,濃度8~10 mmol·L-1時(shí)接近半致死。NaN3誘變處理小麥種子發(fā)現(xiàn),5 mmol·L-1處理傷害過輕,15 mmol·L-1處理傷害過重,結(jié)合實(shí)驗(yàn)室及田間數(shù)據(jù)分析,確定適宜劑量為10 mmol·L-1[7],其試驗(yàn)結(jié)果與本研究類似。除了NaN3溶液濃度,誘變處理時(shí)間同樣會(huì)顯著影響誘變效果。如在NaN3誘變處理紐荷爾臍橙枝條腋芽中,濃度同樣為10 mmol·L-1,當(dāng)處理時(shí)間由3 h延長到24 h時(shí),紐荷爾臍橙枝條的存活率由64%顯著降低到接近半致死率的51.7%[30]。本研究中,10 mmol·L-1的NaN3溶液處理時(shí)間由4 h延長到12 h時(shí)同樣發(fā)現(xiàn),杉木種子發(fā)芽率由19.67%顯著降低到3.00%。在‘巴西蕉’不定芽誘變處理中,綜合NaN3濃度及處理時(shí)間對(duì)不定芽增殖、致死率的誘變效應(yīng),確定誘變適宜的條件為2.31 mmol·L-1的NaN3溶液處理3 h和3.08 mmol·L-1的NaN3溶液處理2 h[31]。由此可見,NaN3濃度及處理時(shí)間對(duì)植物材料的誘變效應(yīng)是累積的,即較高濃度的誘變劑進(jìn)行短時(shí)間處理或較低濃度長時(shí)間處理都可以使誘變后的植物材料達(dá)到半致死效果。本研究中,10 mmol·L-1的NaN3處理12 h可能對(duì)杉木種子造成了嚴(yán)重傷害,種子發(fā)芽率降低到3.00%,NaN3濃度及處理時(shí)間對(duì)杉木種子的累積誘變效應(yīng)已接近完全致死。當(dāng)把濃度降低到8 mmol·L-1或者處理時(shí)間減少到4 h時(shí),誘變劑NaN3對(duì)杉木種子的傷害隨之減輕,表現(xiàn)在發(fā)芽率從接近致死狀態(tài)顯著升高到接近半致死,因此,本研究確定NaN3誘變處理杉木種子的適宜條件為10 mmol·L-1處理4 h或8 mmol·L-1處理12 h。利用該方法進(jìn)行杉木種子誘變,可使得種子發(fā)芽達(dá)到半致死,且誘導(dǎo)幼苗群體株高矮化、莖粗變細(xì)、側(cè)枝數(shù)量改變。這些表型指標(biāo)發(fā)生明顯變化的誘變苗群體,為選育優(yōu)質(zhì)、抗逆的杉木新種質(zhì)提供材料。
參 考 文 獻(xiàn)
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