薛強(qiáng)，黃東宗，周奕丞，武英，李云，時(shí)瑞霞，楊青(華北理工大學(xué)，河北唐山0600； 959部隊(duì)； 遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)；唐山市開(kāi)灤總醫(yī)院)

研究發(fā)現(xiàn)，高血壓患者同時(shí)患有糖尿病的概率明顯高于一般人群[1]，而糖尿病人群高血壓的患病率是一般人群的2～3倍[2]。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)具有調(diào)節(jié)水、電解質(zhì)平衡等重要作用，高血壓患者通常伴有RAAS活性增加[3]，而RAAS活性過(guò)高與微循環(huán)改變具有協(xié)同作用，可影響胰島素主要分泌器官和胰島素敏感性，同時(shí)損害細(xì)胞對(duì)胰島素信號(hào)的反應(yīng)[4]， 進(jìn)而影響血糖代謝。高血壓與糖尿病均存在發(fā)病家庭聚集現(xiàn)象，提示兩種病可能受某些遺傳因素的影響。本文通過(guò)觀察高血壓并發(fā)糖尿病患者RAAS相關(guān)微小核糖核酸(miRNA)基因多態(tài)性，分析高血壓并發(fā)糖尿病的易感基因，探討高血壓并發(fā)糖尿病的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年5月～2017年3月唐山市開(kāi)灤總醫(yī)院收治的高血壓并發(fā)糖尿病患者511例(觀察組)及單純高血壓患者476例(對(duì)照組)，均依據(jù)《中國(guó)高血壓防治指南》(2010版)及WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)(1999年)明確診斷。排除患有嚴(yán)重心、肺、腦、腎疾病及腫瘤患者。觀察組男408例、女103例，年齡(62.61±7.98)歲；對(duì)照組男305例、女171例，年齡(63.46±8.10)歲；組間比較P均>0.05。觀察組空腹血糖(FPG)、低密度脂蛋白(LDL)、TG、TC、BMI均高于對(duì)照組(P均<0.05)，兩組收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、高密度脂蛋白(HDL)比較P均>0.05。見(jiàn)表1。

表1 兩組一般資料比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

1.2 基因位點(diǎn)選擇 利用mirWALK以及HMDD數(shù)據(jù)庫(kù)提供的miRNA信息，結(jié)合Pubmed等數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的分子生物信息學(xué)方面既往文獻(xiàn)，篩選在中國(guó)人群具有較高突變頻率且與高血壓及糖尿病相關(guān)或RAAS相關(guān)的miRNA；利用miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件miRANDA、TargetScan及ensemble基因組瀏覽器預(yù)測(cè)和篩選RASS相關(guān)miRNA靶基因結(jié)合區(qū)內(nèi)最小等位基因頻率MAF≥5%，且Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)P>0.01的所有單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，最終篩選出可能與高血壓并發(fā)糖尿病相關(guān)的基因及位點(diǎn)，即miR-124相關(guān)CYP11B2基因rs531564位點(diǎn)、miR-20相關(guān)INSR基因rs1366600位點(diǎn)。

1.3 基因多態(tài)性檢測(cè) 兩組均于清晨抽取空腹?fàn)顟B(tài)下肘靜脈血6 mL，EDTA抗凝，常溫3 500 r/min離心10 min，取上清。利用小量全血基因組DNA提取試劑盒提取全血DNA，測(cè)定DNA濃度，稀釋至10 μg/L，- 20 ℃留存待用。將留存DNA樣本恢復(fù)至室溫，首先進(jìn)行PCR引物擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物配置不同濃度瓊脂糖凝膠，加入TBE緩沖液，加熱至完全溶解，取出溶液冷卻至60 ℃左右，加入1.5 μL溴化乙錠至濃度為0.5 μg/mL，混勻倒膜后待其冷卻凝固，完成瓊脂糖凝膠制作。應(yīng)用Taqman熒光探針?lè)ㄟM(jìn)行基因分型，miR-124相關(guān)CYP11B2基因rs531564位點(diǎn)引物序列：上游引物：5′-GAGGGGAG-GGGTCTGGAG-3′；下游引物：5′-GCCCAGAGAAAA-ATCTGCACACGCGTCGACCCATTTCTCGGGGACCC-TT-3′；miR-20相關(guān)INSR基因rs136600位點(diǎn)引物序列：上游引物：5′-CTAGCTAGCTCCTTGACACCTTAGGCTC-3′；下游引物： 5′-ACGCGTCGACCCATTTCTC-GGGGACCCTT-3′。加熱DNA至95 ℃保持15 s 使其變性，60 ℃保持1 min使引物和探針退火及延伸，共40個(gè)循環(huán)。使用凝膠電泳成像系統(tǒng)在合適的曝光條件下顯影并照相保存圖膠留存觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

兩組均進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，各位點(diǎn)基因頻率處于遺傳平衡狀態(tài)，樣本具有群體代表性。兩組miR-124 CYP11B2基因rs531564位點(diǎn)三種基因型GG、GC、CC分布頻率及G、C等位基因分布頻率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見(jiàn)表2。兩組miR-20 相關(guān)INSR基因rs1366600位點(diǎn)三種基因型TT、TC、CC分布頻率及T、C等位基因分布頻率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，見(jiàn)表3。

表2 兩組miR-124相關(guān)CYP11B2基因rs531564位點(diǎn)基因型及等位基因分布比較[例(%)]

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

表3 兩組miR-20相關(guān)INSR基因rs1366600位點(diǎn)基因型及等位基因分布[例(%)]

3 討論

高血壓、糖尿病作為心腦血管疾病的主要危險(xiǎn)因素，二者存在一定的發(fā)病聚集性[5]，罹患此兩種疾病可使心腦血管疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)一步增加。RAAS主要由腎素、血管緊張素、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ及醛固酮等構(gòu)成[6]，該系統(tǒng)在高血壓及糖尿病發(fā)生發(fā)展中的作用越來(lái)越受到重視。高血壓患者常伴有RAAS活性增加，RAAS持續(xù)激活是導(dǎo)致高血壓的一個(gè)重要因素[7]，RAAS活性越高，F(xiàn)BG水平越高，患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)越大[8]。

miRNA是一種內(nèi)源性非編碼RNA，通過(guò)與靶基因的3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)結(jié)合，直接降解靶基因mRNA或抑制其靶基因的翻譯過(guò)程，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮基因調(diào)控作用。miRNA調(diào)節(jié)著人類約1/3的蛋白質(zhì)編碼基因。研究發(fā)現(xiàn)，miR-124不僅與RAAS激活相關(guān)[9]，其相關(guān)rs531564位點(diǎn)與消化系統(tǒng)惡性腫瘤、宮頸癌發(fā)病的相關(guān)性近年亦被關(guān)注。既往研究證實(shí)，CYP11B2基因在高血壓患者中呈多態(tài)性分布，已成為原發(fā)性高血壓的候選基因[10]。CYP11B2基因相關(guān)位點(diǎn)與RAAS激活同樣存在關(guān)聯(lián)[11]。最近一個(gè)關(guān)于中國(guó)漢族人群的研究發(fā)現(xiàn)，miR-124影響中國(guó)人群代謝綜合征的發(fā)生，miR-124a rs531564位點(diǎn)CC基因型表達(dá)成熟miR-124a的數(shù)量較GG基因型少20%，rs531564位點(diǎn)G等位基因?qū)е鲁墒靘iR-124過(guò)表達(dá)，推測(cè)miR-124基因rs531564位點(diǎn)多態(tài)性可能與中國(guó)人群代謝綜合征有關(guān)[12,13]。

Ober等[13]最早報(bào)道INSR基因變異可增加糖尿病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。INSR基因rs1799817位點(diǎn)少見(jiàn)的T等位基因?yàn)槟嫌《热?型糖尿病的保護(hù)因素[14]。miR-20作為參與調(diào)控INSR的基因位點(diǎn)[15]，其rs1366600位點(diǎn)位于miR-20的3′-UTR區(qū)域[16]。有報(bào)道顯示，攜帶rs1366600位點(diǎn)C等位基因的孕婦餐后2 h的血糖水平更高，提示該位點(diǎn)的C等位基因可能與糖尿病發(fā)病相關(guān)[17]。目前關(guān)于rs1366600位點(diǎn)多態(tài)性與高血壓并發(fā)糖尿病的關(guān)系未見(jiàn)報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，高血壓并發(fā)糖尿病患者miR-124相關(guān)CYP11B2基因rs531564位點(diǎn)GC、CC基因型及C等位基因分布頻率均低于單純高血壓患者，GG基因型及G等位基因分布頻率均高于單純高血壓患者，推測(cè)該位點(diǎn)C等位基因表達(dá)降低、G等位基因表達(dá)升高可能促進(jìn)高血壓并發(fā)糖尿病的發(fā)生，C等位基因可能是高血壓并發(fā)糖尿病的保護(hù)基因，G等位基因可能是高血壓并發(fā)糖尿病的促發(fā)或危險(xiǎn)基因。上述結(jié)果與對(duì)羅馬人群2型糖尿病易感性基因研究的相關(guān)結(jié)果[18]基本一致。但是，高血壓并發(fā)糖尿病究竟是C等位基因降低還是G等位基因增加，抑或是二者共同造成的結(jié)果，還需進(jìn)一步研究。此外，本研究結(jié)果顯示，高血壓并發(fā)糖尿病患者與單純高血壓患者miR-20相關(guān)INSR基因rs1366600位點(diǎn)T、C基因型及等位基因頻率分布未見(jiàn)差異，推測(cè)該位點(diǎn)可能對(duì)高血壓并發(fā)糖尿病的發(fā)生無(wú)明顯影響。

綜上所述，RAAS相關(guān)miR-124 CYP11B2基因rs531564位點(diǎn)多態(tài)性可能參與了高血壓并發(fā)糖尿病的發(fā)生，miR-20 INSR基因rs1366600位點(diǎn)多態(tài)性可能與高血壓并發(fā)糖尿病的發(fā)生無(wú)關(guān)。

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