茶多酚對(duì)過(guò)氧化氫損傷PC12細(xì)胞活性氧簇的影響

鄧?guó)P君 肖 凌 楊吟宇 李新才*

（益陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，湖南 益陽(yáng) 413000）

茶多酚（Tea Polyphenols，TP）是一種抗氧化劑，源自于綠茶，是綠茶中最主要活性成分，有顯著的抗氧化、抗炎等作用。能抑制與自由基有關(guān)的酶，抑制氧化酶系，如抑制細(xì)胞色素P2450環(huán)氧酶、氧化酶黃嘌呤氧化酶系（XO）等。TP亦能高效清除自由基，通過(guò)直接作用于自由基、再生或保護(hù)體內(nèi)高效抗氧化劑、絡(luò)合誘導(dǎo)氧化的過(guò)渡金屬離子，產(chǎn)生顯著的抗氧化作用[1-2]。本研究采用H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷作為受損神經(jīng)細(xì)胞體外模型，從TP對(duì)細(xì)胞活性氧簇的影響等方面研究了TP對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的作用。通過(guò)該研究，希望為T(mén)P應(yīng)用于神經(jīng)損傷性疾病提供可靠實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器：高糖DMEM培養(yǎng)基（GIBCO公司，USA），胎牛血清（FBS，杭州四季青生物公司）。噻唑藍(lán)（MTT，Sigma-Aldrich，USA），二甲基亞砜（DMSO，UNI-CHEM公司）；TP（質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，江西綠康天然產(chǎn)物有限責(zé)任公司），過(guò)氧化氫（H2O2，汕頭光華化學(xué)廠），NO試劑盒（南京建成），iNOS試劑盒（南京建成），超氧自由基試劑盒（O·2-，南京建成），羥自由基試劑盒（·OH，南京建成）。超聲波清洗器（中國(guó)華南超聲波設(shè)備廠），離心機(jī)（TGL-16aR，上海安亭科學(xué)儀器廠），酶標(biāo)儀（Model 680，Bio-RAD，USA），倒置相差顯微鏡（XDS-1B，Olympus，日本），752型紫外分光光度計(jì)（上海第二分析儀器廠）。PC12細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)，源于大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞。

1.1.2 溶液配制：TP：稱取適量，用無(wú)血清的DMEM配置成一定濃度的母液，過(guò)濾除菌后用無(wú)血清的DMEM稀釋成所需濃度，現(xiàn)用現(xiàn)配。H2O2：取適量，過(guò)濾除菌，避光貯存4 ℃，臨用前用無(wú)血清的DMEM配置成所需濃度。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理：PC12細(xì)胞種植于50 mL培養(yǎng)瓶中（2×105/mL），DMEM高糖培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素），置37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，每24 h換培養(yǎng)液1次，每48 h約80%滿瓶時(shí)傳代[3]。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC12細(xì)胞，以每孔2×105/mL分別接種在96孔板（MTT實(shí)驗(yàn)）或6孔板中（O·2-、·OH、NO、iNOS的測(cè)定實(shí)驗(yàn)），于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育，24 h內(nèi)細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合后，同步化細(xì)胞（即用含體積分?jǐn)?shù)0.01%胎牛血清的DMEM孵育細(xì)胞24 h）。TP（終濃度分別為5、10、20 μmol/L）預(yù)孵育細(xì)胞1 h，加入H2O2（終濃度500 μmol/L）共同培養(yǎng)2 h。

1.2.2 MTT實(shí)驗(yàn)建立H2O2損傷PC12細(xì)胞模型：PC12細(xì)胞損傷模型用MTT實(shí)驗(yàn)確立[4]。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種在96孔板（每孔2×105/mL），如“1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和處理”所述接種、孵育、同步化。設(shè)7個(gè)組，空白對(duì)照組與6個(gè)不同濃度H2O2組?？瞻讓?duì)照組加入等量的培養(yǎng)液使H2O2終濃度0 μmol/L，其余6組分別加入H2O2（終濃度100～600 μmol/L）孵育2 h，空白對(duì)照組與各個(gè)H2O2濃度組及均設(shè)6個(gè)平行孔。吸棄培養(yǎng)液，加終濃度1 g/L MTT液，孵育4 h后吸棄上清，每孔加DMSO 150 μL，平板震蕩儀輕輕震蕩5 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值（570 nm）。細(xì)胞存活率按公式計(jì)算：細(xì)胞存活率=A570（處理組）/A570（對(duì)照組）×100%。

表2 TP對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞O·2-、·OH水平的影響（±s）

表2 TP對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞O·2-、·OH水平的影響（±s）

注：#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01 vs.空白對(duì)照組；**P ＜ 0.01 vs. H2O2模型組

組別 n(平行孔數(shù)) 抑制O·2-活性(U/L) 產(chǎn)生·OH能力(U/mL)空白對(duì)照組 3 267.22±15.38 903.23±2.21 H2O2組 3 -12.12±1.24## 1254.45±2.32##TP 5 μmol/L + H2O2組 3 39.62±8.25** 1034.39±15.23**TP 10 μmol/L + H2O2組 3 183.81±10.27** 954.87±18.43**TP 20 μmol/L + H2O2組 3 202.26±15.71** 917.39±1.64**F 168.176 490.945 P 0.000 0.000

表3 TP對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞iNOS活性、NO水平的影響（±s）

表3 TP對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞iNOS活性、NO水平的影響（±s）

注：##P＜0.01 vs. 空白對(duì)照組；**P＜0.01 vs. H2O2模型組

組別 n(平行孔數(shù)) iNOS 活性(U/mL) NO水平(μmol/L)空白對(duì)照組 3 5.39 ±0.07 389.55±74.83 H2O2模型組 3 33.44±2.27## 1747.36±21.42##TP 5 μmol/L + H2O2組 3 20.28±0.31** 1184.51±22.45**TP 10 μmol/L + H2O2組 3 19.27±0.21** 919.37±22.45**TP 20 μmol/L + H2O2組 3 15.27±0.63** 688.63±73.12**F 223.127 271.059 P 0.000 0.000

1.2.3 測(cè)定受損PC12細(xì)胞O·2-活性：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種在6孔板（每孔2×105/mL），如“1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和處理”所述接種、孵育、同步化。分為5組，空白對(duì)照組（加入等量的培養(yǎng)液），H2O2模型組（僅加入終濃度500 μmol/L H2O2），3種不同濃度的TP組（加入TP使終濃度5、10、20 μmol/L預(yù)孵1 h，再加終濃度500 μmol/L H2O2共同培養(yǎng)2 h），每組均設(shè)3個(gè)平行孔。藥物處理完畢后棄培養(yǎng)液，0.125% 胰蛋白酶消化細(xì)胞使之脫壁，每樣本細(xì)胞數(shù)為（1～5）×106，義，400～600 μmol/L劑量組降低細(xì)胞活力顯著，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，表1）。1500 rpm（離心半徑6 cm，離心力151 xg），離心5 min，收集細(xì)胞至0.5 mL裂解緩沖液（0.1 mol/L PBS 中含0.5% Triton X-100，pH 7.0），用超聲粉碎儀震蕩處理，破碎細(xì)胞，直至顯微鏡下觀大部分細(xì)胞已破碎，4 ℃，1200 rpm（離心半徑6 cm，離心力97 xg），20 min離心。取細(xì)胞破碎后上清，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行測(cè)試。

圖1 H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞形態(tài)學(xué)（×100）

1.2.4 受損PC12細(xì)胞·OH活性的測(cè)定：依據(jù)1.2.3法，收集細(xì)胞破碎后的上清液，采用Fenton法，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行測(cè)試。

1.2.5 受損PC12細(xì)胞NO含量的測(cè)定：按照1.2.3法處理細(xì)胞。即，細(xì)胞接種在6孔板（每孔2×105/mL），如“1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和處理”所述接種、孵育、同步化。分為5組，空白對(duì)照組（加入等量的培養(yǎng)液），H2O2模型組（僅加入終濃度500 μmol/L H2O2），3種不同濃度的TP組（加入TP使終濃度5、10、20 μmol/L預(yù)孵1 h，再加終濃度500 μmol/L H2O2共同培養(yǎng)2 h），每組均設(shè)3個(gè)平行孔。藥物處理完畢后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，采用硝酸還原酶法，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行測(cè)試。

1.2.6 受損PC12細(xì)胞iNOS活性的測(cè)定：依據(jù)1.2.3法收集細(xì)胞破碎后的上清液，根據(jù)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行測(cè)試。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（±s）表示。SPSS16.0軟件做統(tǒng)計(jì)處理，數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析 ，各組之間多重比較采用LSD或Dunnett's多重比較法。采用LSD多重比較法分析O·2-、iNOS與NO活性；Dunnett T3多重比較法分析·OH活性。P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞活力改變（±s）

表1 H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞活力改變（±s）

注：**P ＜ 0.01 vs. 0 μmol/L組（空白對(duì)照組）

組別 n(平行孔數(shù)) 細(xì)胞存活率(%)0 μmol/L 組(空白對(duì)照組) 6 100.0±0.0 100 μmol/L組 6 88.8±9.6 200 μmol/L組 6 101.3±6.6 300 μmol/L組 6 75.7±21.2 400 μmol/L組 6 48.7±8.1**500 μmol/L組 6 47.0±3.8**600 μmol/L組 6 44.3±4.0**F 39.80 P 0.000

2.2 TP對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞內(nèi)O·2-、·OH、iNOS與細(xì)胞外NO水平的影響：為證實(shí)TP對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞細(xì)胞活性氧簇的作用，我們檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)O·2-、·OH、iNOS與細(xì)胞外NO水平。H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞損傷后，細(xì)胞內(nèi)抑制O·2-活性能力下降，產(chǎn)生·OH能力增加，與空白對(duì)照組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01，表2）。TP預(yù)孵育1 h，5、10、

2 結(jié) 果

2.1 H2O2對(duì)PC12細(xì)胞損傷作用：由圖1可見(jiàn)，空白對(duì)照組PC12細(xì)胞分布均勻且體積飽滿，各損傷組細(xì)胞體積明顯縮小，胞體萎縮，突起消失，細(xì)胞間隙增大，表面光滑。損傷程度以600 μmol/L最嚴(yán)重。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果亦顯示，H2O2孵育PC12細(xì)胞2 h，細(xì)胞受損顯著，與空白對(duì)照組相比，100～300 μmol/L劑量組細(xì)胞活力降低，但是沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意20 μmol/L 3個(gè)TP濃度組細(xì)胞內(nèi)顯著抑制O·2-活性，減少·OH產(chǎn)生，與H2O2模型組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01，表2）。H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞損傷后，細(xì)胞內(nèi)iNOS活性與細(xì)胞外NO水平明顯上升，與空白對(duì)照組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01，表2）。TP預(yù)孵育1 h，5、10、20 μmol/L 3個(gè)TP濃度組細(xì)胞內(nèi)iNOS活性與細(xì)胞外NO水平下降，與H2O2組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01，表3）。說(shuō)明TP能有效拮抗H2O2導(dǎo)致的氧自由基活性的增加。

3 討 論

TP是源自茶葉的高效天然的抗氧化劑，能清除自由基，具有抗衰老、提高免疫力、防癌、抗炎等一系列優(yōu)異功能。TP易過(guò)血腦屏障，清除自由基[5]。因此我們假定它也許能保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，治療神經(jīng)細(xì)胞損傷性疾病。

PC12細(xì)胞為大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤克隆化的細(xì)胞株，常常被廣泛用來(lái)研究帕金森病、阿爾茨海默病等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病[6]。H2O2是最主要最穩(wěn)定的ROS家族成員，亦能夠穿透并且損傷生物膜、線粒體，所以H2O2常常作為毒性物質(zhì)來(lái)模擬氧化應(yīng)激體外模型[7]。因而，本研究使用H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷作為神經(jīng)損傷體外模型來(lái)評(píng)價(jià)TP對(duì)受損神經(jīng)細(xì)胞活性氧簇的影響。

有氧代謝過(guò)程中機(jī)體會(huì)產(chǎn)生ROS，主要包括H2O2、O·2-、·OH和NO等。當(dāng)機(jī)體受到刺激性因素作用而處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平就會(huì)升高，損害機(jī)體引起多種途徑的細(xì)胞功能紊亂。O·2-自由基是形成單線態(tài)氧和羥自由基（·OH）的前體之一，并能夠間接啟動(dòng)脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，破壞生物大分子如DNA、酶等。羥自由基（·OH）在體內(nèi)的形成主要是由過(guò)氧化物負(fù)離子和過(guò)氧化氫（H2O2）反應(yīng)生成，羥自由基能殺死紅細(xì)胞，降解DNA、細(xì)胞膜和多糖化合物[8]?；钚匝醮氐牧硪恢饕蓡T是NO，過(guò)量的NO參與許多病理?yè)p傷過(guò)程，對(duì)機(jī)體具有毒性作用。而iNOS能誘導(dǎo)產(chǎn)生NO，iNOS生理情況基本不存在，當(dāng)存在感染、缺血、損傷等誘導(dǎo)因素時(shí)，刺激iNOS-mRNA表達(dá)，持續(xù)大量生成NO，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加，成為強(qiáng)自由基，破壞呼吸鏈，耗竭ATP，損傷DNA，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[10]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，當(dāng)神經(jīng)組織處于創(chuàng)傷缺血等條件下，iNOS·NO通路激活，使神經(jīng)組織局部NO增多，參與神經(jīng)細(xì)胞的損傷過(guò)程[9]。

本研究結(jié)果顯示，PC12細(xì)胞經(jīng)H2O2誘導(dǎo)損傷后，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生·OH能力迅速增加，抑制O·2-活性能力急劇下降，采用TP預(yù)孵育1 h，各TP濃度組細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生·OH能力急劇減少，抑制O·2-活性能力顯著增加。同時(shí)細(xì)胞經(jīng)H2O2誘導(dǎo)損傷后，細(xì)胞iNOS與NO水平急劇上升，但TP預(yù)孵育1 h，各TP濃度組細(xì)胞iNOS與NO水平下降。說(shuō)明TP能有效拮抗H2O2導(dǎo)致的氧自由基活性的增加，抑制iNOS·NO通路的激活。

綜上所述，TP能降低受損P12細(xì)胞內(nèi)活性氧簇水平，結(jié)合本課題的其他研究結(jié)果[10]，說(shuō)明TP對(duì)受損神經(jīng)細(xì)胞有一定的保護(hù)作用，其可能的機(jī)制之一是TP能降低受損P12細(xì)胞內(nèi)活性氧簇水平。但是尚需進(jìn)一步研究TP抑制H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的分子信號(hào)機(jī)制。

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