高效液相色譜法測(cè)定甘草鋅顆粒中甘草酸的含量

孟慶山 王嘉偉 楚合法 邢 燕 鞏騰飛

（威海市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 威海 264200）

甘草鋅顆粒是應(yīng)用于臨床的抗?jié)兒脱a(bǔ)鋅藥物之一，其主要成分為甘草根提取物甘草酸與鋅結(jié)合的生成的藥物，具有抗炎、消腫、收斂及促進(jìn)黏膜再生和加速潰瘍愈合的作用，可用于缺鋅引起的兒童厭食、生長(zhǎng)發(fā)育不良，尋常型痤瘡，口腔潰瘍及成人鋅缺乏癥等[1]。該藥中甘草酸含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法，采用聚酰胺柱層析-紫外法[2]，早期也出現(xiàn)過薄層色譜法、重量法、氣相色譜法、比色法，但是這些方法測(cè)定甘草酸含量操作繁瑣，重現(xiàn)性差，近年來國(guó)內(nèi)外報(bào)道有高效液相色譜法[3]，《中國(guó)藥典》2015年版一部中，甘草酸含量測(cè)定也普遍采用了高效液相色譜法，本文以甘草酸銨為外標(biāo)，用HPLC法測(cè)定甘草鋅顆粒中甘草酸的含量，結(jié)果標(biāo)明，此法操作簡(jiǎn)單，甘草酸與相鄰峰有較好的分離度，結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好。

1 儀器與試藥

1.1 儀器：島津LC-20AT高效液相色譜儀（LC Solution工作站）；島津UV-2401PC型紫外-可見分光光度計(jì)；梅特勒MS105DU型電子天平；梅特勒FE20 Plus型pH計(jì)

1.2 試藥：甘草酸銨對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110731-201116，含量93.1%）；甘草鋅顆粒（廠家A，批號(hào)150702，160803，160904），甲醇為色譜純，水為娃哈哈純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件：InertSustain C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，序列號(hào)：SN 4CR98043）；流動(dòng)相為甲醇-1%的醋酸溶液（用氨水調(diào)pH至4.0）（66∶34）；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)252 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液取甘草酸銨對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相溶解并制成含甘草酸濃度為25.9 μg/mL的溶液，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液取裝量差異項(xiàng)下的供試品，研細(xì)，取約0.25 g，精密稱定，置200 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液按甘草鋅顆粒處方比例制備不含甘草鋅的陰性樣品，照“2.2.2”項(xiàng)下方法制成陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)及專屬性試驗(yàn)：《中國(guó)藥典》2015年版一部中采用HPLC法測(cè)甘草酸的含量，檢測(cè)波長(zhǎng)既有采用250 nm[4]，也有采用252 nm[5]，本文取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，用紫外-可見分光光度計(jì)在190～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，該溶液在252 nm處有最大吸收，見圖1。故本文建立的色譜條件下選用252 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 紫外吸收光譜圖

取對(duì)照品溶液，供試品溶液和陰性樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，供試品色譜圖中主峰保留時(shí)間與對(duì)照品色譜圖主峰保留時(shí)間一致；陰性樣品對(duì)甘草酸的測(cè)定無干擾；供試品甘草酸峰的理論塔板數(shù)為3600，與相鄰峰的分離度分別為2.3，3.0，滿足定量要求，見圖2。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

圖2 HPLC色譜圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察：分別精密吸取對(duì)照品溶液2、6、10、14、18、22 μL，按上述條件分別注入液相色譜儀測(cè)定，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程為Y=2.3229×104X-1.1495×103，r=1.0000，結(jié)果表明，進(jìn)樣量在0.0518～0.5698 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4.2 精密度試驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品溶液10μL，按“2.1”所述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)的甘草酸的峰面積的RSD為0.24%結(jié)果表明精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品（批號(hào)：160803），按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果甘草酸平均含量為17.68 mg/g，其RSD為0.53%。

2.4.4 供試品溶液穩(wěn)定性考察：取同一供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、4、8、12、16、20、24、28、32、36 h進(jìn)樣測(cè)定甘草酸的峰面積。所得峰面積的RSD為0.20%。結(jié)果表明，供試品溶液室溫放置36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 加樣回收試驗(yàn)：精密稱取已知含量的同一批樣品（批號(hào)：160803）約0.13 g，共6份，分別精密加入對(duì)照品溶液（以甘草酸計(jì)，濃度為1.0 mg/mL）2 mL，按供試品溶液制備方法制備，依法測(cè)定甘草酸的含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.4.6 樣品測(cè)定：取樣品3批，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定甘草酸的含量，每個(gè)批號(hào)平行測(cè)3次，結(jié)果見表2。

表2 樣品中甘草酸的含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討 論

3.1 《中國(guó)藥典》2015年版一部中，HPLC法測(cè)定甘草酸含量，主要采用甲醇-醋酸溶液體系、甲醇-醋酸銨體系、甲醇-磷酸鹽體系、乙腈-磷酸鹽體系、乙腈-磷酸溶液體系、乙腈-醋酸溶液體系[5-9]，文獻(xiàn)報(bào)道的方法中，流動(dòng)相用甲醇-醋酸銨（含2%冰醋酸）體系[10]，本文在實(shí)驗(yàn)中，考察了上述不同體系，不同比例的流動(dòng)相，但是甘草酸與相鄰峰分離度均達(dá)不到藥典要求。通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值發(fā)現(xiàn)，pH值對(duì)分離度影響較大，最后甲醇-1%的醋酸溶液（用氨水調(diào)pH至4.0）（66∶34）體系，甘草酸峰形好，柱效高，達(dá)到良好的分離效果。

3.2 甘草酸的純品很難得到，而其銨鹽容易結(jié)晶，易得到純品，且在酸性流動(dòng)相體系中，仍以甘草酸形式存在，不影響測(cè)定及結(jié)果計(jì)算[11]，故選擇甘草酸銨對(duì)照品，用外標(biāo)法測(cè)定。

3.3 本研究顯示同一廠家不同批次的甘草鋅顆粒，臨近保質(zhì)期的批次甘草酸含量偏低，提示質(zhì)量控制過程中應(yīng)考慮保質(zhì)期設(shè)置的安全合理性。

3.4 本文采用的高效液相色譜法，色譜條件簡(jiǎn)單，分離度符合要求，方法準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，樣品前處理方便，對(duì)甘草鋅顆粒的質(zhì)量控制具有一定的參考價(jià)值。

[1] 金芝貴,吳飛華,吳嵐,等.甘草鋅顆粒治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍療效觀察[J].上海中醫(yī)藥雜志,2005,39(7):33-34.

[2] 衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)[S].第九冊(cè),89-90.

[3] 梁月琴,劉琴棣,吳德政.高效液相色譜法測(cè)定甘草及其制劑中甘草酸含量[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,1997,26(8):33-35.

[4] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].2015年版.一部.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015:810.

[5] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].2015年版.一部.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015:757.

[6] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].2015年版.一部.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015:565.

[7] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].2015年版.一部.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015:700.

[8] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].2015年版.一部.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015:1142.

[9] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].2015年版.一部.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015:625.

[10] 曹玲,樊夏雷.RP-HPLC法測(cè)定甘草鋅顆粒中甘草酸的含量[J].藥學(xué)與臨床研究,2007,15(4):292-294.

[11] 孫文基,謝世昌.天然藥物成分定量分析[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2003:205.