血清學(xué)篩查聯(lián)合無創(chuàng)產(chǎn)前檢測在胎兒常見非整倍體篩查中的應(yīng)用

葉強(qiáng)，胡勤，鐘強(qiáng)，梁屹，韋懿

伴隨著二胎政策的開放，高齡孕婦人數(shù)顯著增加，研究發(fā)現(xiàn)孕婦年齡與胎兒染色體疾病發(fā)生率呈正相關(guān)[1]。單一的血清學(xué)篩查，以其較低的檢出率、較高的漏診率和假陽性率，勢必達(dá)不到產(chǎn)前篩查的目的[2]。在川南地區(qū)，常以血清學(xué)篩查聯(lián)合染色體核型分析進(jìn)行產(chǎn)前篩查。但是，這種侵入性方法獲取胎兒組織（如絨毛活檢、羊膜腔穿刺、經(jīng)腹臍靜脈穿刺），會(huì)造成0.5%～1%的胎兒流產(chǎn)，同時(shí)引起孕婦和家人的焦慮、恐懼等[3]。并且部分介入性產(chǎn)前診斷禁忌證者（先兆流產(chǎn)、發(fā)熱、有出血傾向、感染未愈等）、懷有珍貴兒的孕婦等拒絕侵入性診斷，進(jìn)而導(dǎo)致唐氏綜合征和愛得華斯（Edwards）綜合征患兒的出生，給家庭及社會(huì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)壓力設(shè)精神壓力。無創(chuàng)產(chǎn)前檢測（NIPT）檢測孕婦外周血中胎兒游離DNA（cell free fetal DNA，cff DNA）[4-6]，具有無創(chuàng)傷性、高的檢出率和低的假陽性率、適用的孕周范圍較大、臨床所需信息少，流程較簡單，質(zhì)量控制相對(duì)容易等優(yōu)點(diǎn)[7]。本文旨在研究血清學(xué)篩查聯(lián)合無創(chuàng)產(chǎn)前檢測篩查胎兒唐氏綜合征和愛得華斯（Edwards）綜合征，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較分析。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年9月～2016年9月本院婦產(chǎn)科門診就診且自愿進(jìn)行血清學(xué)篩查和NIPT檢測的孕婦364例，詳細(xì)詢問并記錄孕婦年齡、孕周、末次月經(jīng)時(shí)間、孕產(chǎn)次和既往分娩史。

1.2 方法

1.2.1 血清學(xué)篩查 抽取孕婦2 ml靜脈血定量檢測甲胎蛋白（AFP）和絨毛膜促性腺激素（HCG），結(jié)合孕婦的年齡、采血時(shí)的準(zhǔn)確孕周，應(yīng)用計(jì)算機(jī)軟件檢測胎兒患某些疾病的危險(xiǎn)系數(shù)。本院T21臨界風(fēng)險(xiǎn)為1/1 000≤T21風(fēng)險(xiǎn)值＜1/270，高風(fēng)險(xiǎn)為≥1/270，T18臨界風(fēng)險(xiǎn)為1/1 000≤T18風(fēng)險(xiǎn)值＜1/350，高風(fēng)險(xiǎn)為≥1/350。

1.2.2 無創(chuàng)產(chǎn)前檢測和數(shù)據(jù)分析 采取5 ml孕婦外周血于Streck Cell-Free DNA BCT采血管中，采用兩步離心法。第一步，在4℃，1 600 g離心15 min，吸去上清血漿，轉(zhuǎn)移至置于冰盒上的2.0 ml離心管，吸掉多余的血漿，吸取白細(xì)胞保存。第二步，初步分離的血漿在4℃，16 000 g離心10 min，分裝至置于冰盒上的2.0 ml離心管。取400 ml血漿利用磁珠法提取，剩余部分保存于-80℃。將提取的DNA進(jìn)行文庫構(gòu)建、定量，最后用Bio Seq 4000測序儀進(jìn)行全基因組測序。

測序結(jié)束后，運(yùn)用《無創(chuàng)產(chǎn)前數(shù)據(jù)分析管理軟件》對(duì)測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到樣本的21號(hào)染色體、18號(hào)染色體、13號(hào)染色體的Z值，根據(jù)每個(gè)樣本的Z值判斷樣本的檢測結(jié)果。其核心算法采用通用函數(shù)計(jì)算Z值，比對(duì)、過濾所得到每個(gè)樣本的唯一匹配reads數(shù)即 unique reads數(shù)，并計(jì)算每個(gè)樣本每條染色體的unique reads數(shù)占該樣本所有染色體unique reads數(shù)百分比%chrN，即reads ratio值。胎兒染色體非整倍體的陽性判斷值及參考區(qū)間設(shè)置如下：陰性-3≤Z＜1.96，臨界（充抽血復(fù)查）1.96≤Z≤3，陽性Z＞3。

1.2.3 無創(chuàng)產(chǎn)前檢測結(jié)果驗(yàn)證 對(duì)所有NIPT檢測孕婦進(jìn)行電話隨訪，記錄新生兒出生后有無外貌、結(jié)構(gòu)及智力發(fā)育異常等。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)篩查各年齡組高風(fēng)險(xiǎn)和臨界風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生率 將孕婦按照年齡分為20歲以下、20～24歲、25～29歲、30～34歲、35～39歲、40～44歲、45以上這8個(gè)組。35歲以下各組之間和35以上各組之間血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)和臨界風(fēng)險(xiǎn)沒有顯著差異；35歲以上的血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)和臨界風(fēng)險(xiǎn)67.65%（23/34）相對(duì)于35歲以下36.26%（153/422）有顯著性差異（P＜0.05），見表1。即35歲為臨界點(diǎn)，35歲以上高齡孕婦發(fā)病率急劇上升，見圖1。

表1 各年齡組血清學(xué)篩查發(fā)生率Table 1 Serological screening rates in all age groups

圖1 各年齡組血清學(xué)篩查發(fā)生率Figure1 Serological screening rates in all age groups

2.2 無創(chuàng)檢測與血清學(xué)檢測的比較 各個(gè)年齡組血清學(xué)篩查的臨界風(fēng)險(xiǎn)和高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦，進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前檢測，結(jié)果均為陰性，隨訪結(jié)果新生兒外貌、結(jié)構(gòu)均無明顯異常，智力發(fā)育良好，見表2。血清學(xué)檢測為低風(fēng)險(xiǎn)的孕婦，NIPT結(jié)果也為陰性（表2中數(shù)據(jù)未例出）。ROC曲線（receiver operating characteristic curve）表明，NIPT相對(duì)于血清學(xué)篩查，有更高的準(zhǔn)確率，見圖2。

3 討論

不進(jìn)行產(chǎn)前診斷和治療性流產(chǎn)的情況下，發(fā)達(dá)國家DS胎兒的出生率為1‰～2‰，且伴有嚴(yán)重的智力障礙。其中，95%的病例存在21號(hào)染色體的不分離，4%易位，1%嵌合[8]。我國是出生缺陷的高發(fā)國，目前我國出生缺陷的發(fā)生率約在5.6%，每年新增出生缺陷數(shù)約90萬例。染色體疾病是最為嚴(yán)重的出生缺陷之一。其中，21三體、18三體約占圍生期出生缺陷的0.15%，占圍生期常染色體非整倍體的95%左右。目前公認(rèn)最常用、最有效的妊娠早期篩查方案是PAPP-A（血漿蛋白A）、游離β-HCG（人絨毛膜促性腺激素β亞單位）和NT（頸背皮膚透明帶厚度聯(lián)）聯(lián)合篩查[9]。川南地區(qū)，主要采用兩聯(lián)血清學(xué)篩查。在本文中，血清學(xué)篩查35歲以上高風(fēng)險(xiǎn)、臨界風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生率顯著與35歲以下。Eichenlaub-Ritter[10]提出，原因可能是隨著年齡增長，卵母細(xì)胞老化。Kline[11]提出卻是由于延遲受精和精子老化假說。

表2 NIPT與血清學(xué)篩查診斷意義的比較Table 2 Comparison of diagnostic significance between NIPT and serological screening

圖2 無創(chuàng)與血清學(xué)檢測結(jié)果比較Figure2 Comparison of Non-invasive and serological test results

唐氏綜合征和愛得華斯（Edwards）綜合征占出生缺陷比例如此之高，且這種胎兒的出生會(huì)造成嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)，單一的血清學(xué)篩查，是不能滿足要求的。NIPT T21檢出率＞99%、T18、T13檢出率約為98%、99%，且假陽性率約為0.13%[12]。本文中，檢測結(jié)果均為陰性，未發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果，可能是樣本數(shù)量在一定程度上還是偏少。雖然NIPT有極高的檢出率、低的假陽性率，但在檢測染色體平衡易位、嵌合體及環(huán)狀有困難[13]。NIPT作為一種主要的篩選新方法，孕婦不論其年齡大小，均應(yīng)知曉篩查風(fēng)險(xiǎn)以及其性質(zhì)、范圍和意義[14-16]。

綜上所述，本文中血清學(xué)篩查表明，在川南地區(qū)，孕婦在35歲以上T21、T18高風(fēng)險(xiǎn)和臨界風(fēng)險(xiǎn)率顯著增加。NIPT檢測結(jié)果表明，相對(duì)于傳統(tǒng)的孕中期血清學(xué)篩查相比較，具有高特異性和敏感性，且避免了侵入性檢測，更能為孕婦接受。由于無創(chuàng)DNA檢測價(jià)格偏高，所以建議在川南地區(qū)，35歲以下孕婦血清學(xué)檢測為高?；蚺R界，應(yīng)該進(jìn)行無創(chuàng)檢測；35歲以上，可以直接進(jìn)行無創(chuàng)檢測。

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