白藜蘆醇和血根堿對2月齡以內(nèi)犢牛生長性能、 血清指標(biāo)及腹瀉狀況的影響

張衛(wèi)兵 張 蓉 畢研亮 屠 焰 杜漢昌 田忠紅 刁其玉*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點實驗室，奶牛營養(yǎng)學(xué)北京市重點實驗室，北京 100081; 2.山東農(nóng)業(yè)生物免疫技術(shù)工程實驗室，山東銀香偉業(yè)集團(tuán)有限公司，菏澤 274500)

犢牛飼養(yǎng)是牛場中最重要的環(huán)節(jié)，犢牛培育的好壞對其今后生長發(fā)育影響巨大。因此為了改善犢牛的生長和健康，采取適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)措施非常重要[1]。常規(guī)做法是在動物飼糧中添加抗生素作為生長促進(jìn)劑，但抗生素作為飼料添加劑在反芻動物飼糧中的應(yīng)用將趨于尾聲,并且不規(guī)范使用抗生素會帶來許多風(fēng)險，包括抗藥性和抗生素殘留[2-3]，已經(jīng)引起了全社會的廣泛關(guān)注[4]。世界衛(wèi)生組織已經(jīng)確定抗生素耐藥性是世界范圍內(nèi)在人類和獸醫(yī)領(lǐng)域日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[4-5]。因此，自2006年1月起，歐盟禁止使用抗生素(《歐盟公告1831/2003/CEE》，歐盟委員會)。2016年7月，我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布了一項公告，從2017年4月起禁止使用硫酸黏桿菌素作為動物生長促進(jìn)劑(《中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第2428號》)。在畜牧業(yè)生產(chǎn)中，需要尋找經(jīng)濟(jì)有效的生長促進(jìn)劑，既能有利于動物生長性能提高，同時也能消除公眾廣泛關(guān)注的對健康問題影響的疑慮[1]。近年來，植物提取物作為動物生長促進(jìn)劑成為研究熱點,研究表明，單寧、皂甙以及一些中草藥提取物對羊或牛的瘤胃發(fā)酵、營養(yǎng)物質(zhì)消化率和生長性能存在有利影響[6-14]。

白藜蘆醇(resveratrol,RES)是一種非黃酮類多酚物質(zhì)，也是一種天然的植物抗毒素，廣泛存在于葡萄(葡萄皮、葡萄籽中含量較高)、花生及中藥虎杖等植物中[15]。RES及其衍生物具有許多生物活性和藥理作用，包括抗氧化活性，神經(jīng)保護(hù)活性，心臟保護(hù)能力[16]。血根堿(sanguinarine,SAG)，分子式C20H15O5N，是一種苯菲啶異喹啉類生物堿，主要存在于博落回、白屈菜、血水草以及紫堇中，具有抗菌、抗氧化以及抗炎癥作用，也用來控制血吸蟲，此外還具有抗腫瘤特性[17]。

RES和SAG作為飼料添加劑在單胃動物和魚類上進(jìn)行了一些研究[18-22]，但在反芻動物上進(jìn)行的研究很少[12-14]，尤其是在幼齡反芻動物上。因此，本試驗研究了RES和SAG對2月齡以內(nèi)荷斯坦?fàn)倥ＩL性能、血清指標(biāo)及腹瀉狀況的影響，為RES和SAG在犢牛生產(chǎn)中應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

試驗于2015年9—11月在在山東省菏澤市曹縣銀香偉業(yè)第二牧場進(jìn)行。氣溫和相對濕度范圍分別為5～30 ℃和30%～60%。

1.2 試驗飼糧與試驗設(shè)計

代乳粉(milk replacer,MR)，專利編號ZL 02128844.5，北京精準(zhǔn)動物營養(yǎng)研究中心提供。

SAG，純度>99%；RES，純度>98%。二者均購自湖南美可達(dá)生物資源有限公司。

選用飼喂合格初乳后54頭具有相似遺傳背景、體重接近、健康的5日齡中國荷斯坦母犢牛，先在犢牛島內(nèi)飼養(yǎng)，每個犢牛島(1.2 m×2.0 m，墊料為鋸末)飼養(yǎng)1頭犢牛。按照體重和日齡一致原則，采用單因素隨機設(shè)計，將犢牛隨機分為3個處理，每個處理18頭。各處理分別飼喂MR(對照)、MR+0.05 mg/kg BW SAG和MR+4 mg/kg BW RES。隨著犢牛體重增加，SAG和RES添加量每2周調(diào)整1次。

Vieira等[18]對博落回提取物(主要有效成分為SAG，SAG含量≥1.5%)在肉雞飼糧中的使用劑量范圍為0.010～0.045 mg/kg BW，并且在0.035 mg/kg BW的時飼料轉(zhuǎn)化率和增重最好。此外在饒華等[23]在8～25 kg的仔豬上博落回提取物添加量為0.021～0.023 mg/kg BW，本試驗考慮到犢牛可能有部分的MR液體進(jìn)瘤胃，選擇SAG的添加量為0.05 mg/kg BW。RES的添加量來自本

實驗室在綿羊上的推薦量。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗開始前，用強力消毒靈溶液對整個圈舍進(jìn)行全面的噴霧消毒，之后每周對所有欄位重復(fù)消毒1次，每隔2周用10%生石灰溶液消毒牛舍。

MR中不添加抗生素等生長促進(jìn)劑或抗球蟲藥物。各處理犢牛5～11日齡為MR過渡期，過渡期內(nèi)飼喂MR與牛奶的比例逐漸由1∶3增加到3∶1；至犢牛12日齡只飼喂MR。MR用煮沸后冷卻到40～50 ℃的熱水按干物質(zhì)(DM)占12.5%的比例沖泡，使之成為乳液飼喂?fàn)倥?，每日?次飼喂(08: 00、17: 00)。飼喂結(jié)束30 min后自由飲水。日飼喂量為犢牛體重的12%，并隨犢牛體重增長及時調(diào)整。SAG和RES添加到MR液體中，飼喂?fàn)倥！?/p>

14日齡，所有犢牛都離開犢牛島，每個處理犢牛隨機分配到3個牛圈，每圈6頭，每頭犢牛占地約4 m2。同時給所有犢牛提供同一種開食料(開食料中不添加SAG和RES)和清潔飲水，隨意采食。犢牛在60日齡斷奶。開食料組成、MR和開食料營養(yǎng)水平見表1。

1.4 樣品采集

1.4.1 飼料樣品采集

每天進(jìn)行MR和開食料的樣品采集，試驗期內(nèi)的樣品混勻后儲存在自封袋里，-20 ℃保存。每天早上飼喂之前收集各處理試牛前1天的剩料，稱重，再從中采樣并于-20 ℃保存待測。

1.4.2 血液樣品的采集

犢牛60日齡時采集血液樣品。在早晨第1次飼喂前，由頸靜脈抽血約10 mL，傾斜放置至析出血清后，1 509.3×g離心10 min，收集血清于試管中，-20 ℃保存，待測。

1.4.3 腹瀉率

試驗期間每天觀察并及時記錄試驗犢牛的腹瀉情況，試驗結(jié)束時計算腹瀉率。腹瀉率按如下公式計算:

腹瀉率(%)=[(腹瀉頭數(shù)×腹瀉天數(shù))/

(動物頭數(shù)×試驗天數(shù))]×100。

1.4.4 生長性能指標(biāo)

5、14、28、56日齡在晨飼前稱重。5、28、56日齡測量體高、胸圍、體長、十字部高和十字部寬。

表1 開食料組成、MR和開食料營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克開食料提供 The premix provided the following per kg of the starter:Cu (as copper sulfate) 12.5 mg,Fe (as ferrous sulfate) 90 mg,Zn (as zinc sulfate) 100 mg,Mn (as manganese sulfate) 130 mg,I (as potassium iodide) 1.5 mg,Se (as sodium selenite) 0.3 mg,Co (as cobalt chloride) 0.5 mg,VA 15 000 IU,VD35 000 IU,VE 50 mg。

2)營養(yǎng)水平為實測值。Nutrient levels were measured values.

1.5 樣品分析測定

MR和開食料中營養(yǎng)水平的測定方法：總能(GE)使用氧彈量熱儀(C200,IKA Works Inc.,德國)測定；DM含量參照AOAC(1990)(930.15)中的方法測定，在烘箱中于105 ℃下干燥6 h；粗蛋白質(zhì)(CP)含量使用凱氏定氮法[AOAC(1990)(920.87)]測定；粗脂肪(EE)含量使用索氏提取法[AOAC(1990)(920.85)]測定；粗灰分含量參照[AOAC(1990)(924.05)]中的方法測定，在600 ℃的馬福爐中完全燃燒6 h；鈣(Ca)含量使用Perkin-Elmer M9W-700原子吸收分光光度計測定，方法參照[AOAC(1990)(968.08)];磷(P)含量通過鉬釩酸鹽比色法[AOAC(1990)(965.17)]測定；中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量參考張麗英[24]的方法測定。

血清指標(biāo)包括：血清生化指標(biāo)、血清激素指標(biāo)和血清免疫指標(biāo)。游離脂肪酸(FFA)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)濃度，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)活性，總抗氧化力(T-AOC)，丙二醛(MDA)濃度均采用全自動生化分析儀(日立7160，日本)分析，試劑盒購自北京華英生物技術(shù)研究所。尿素氮(UN)濃度用全自動生化分析儀(日立7160，日本)分析，試劑盒購自中生北控股份有限公司。胰島素(INS)、去甲腎上腺素(NE)濃度用全自動放免計數(shù)儀(r-911)測定，試劑盒購自北京華英生物技術(shù)研究所。皮質(zhì)醇(COR)、白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNFα)、γ干擾素(γ-IFN)、生長激素(GH)、類胰島素樣生長因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、表皮生長因子(EGF)濃度用全自動酶標(biāo)儀(STAT FAX 2100，美國)檢測，試劑盒購自北京華英生物技術(shù)研究所。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

用Excel 2013對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，然后采用SAS 9.4統(tǒng)計軟件GLM對各處理ADG、腹瀉率、血清指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，用Mixed模型對其他數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以P<0.05作為差異顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 RES和SAG對犢牛生長性能以及腹瀉狀況的影響

RES和SAG對犢牛生長性能影響結(jié)果見表2。犢牛飼糧由MR和開食料組成，可以看出，與MR處理相比，RES和SAG處理總增重分別提高了1.44、1.85 kg，但各處理間差異不顯著(P>0.05)。各處理DMI差異不顯著(P>0.05)。體重隨著日齡增加而增加，日齡的影響顯著(P<0.000 1)，但是日齡與處理之間不存在交互作用(P=0.853 9)。

在體尺方面，體長在5日齡時SAG處理顯著高于其余2個處理(P<0.05)，但是隨著日齡增長，差異消失(P>0.05)，到56日齡3個處理之間無顯著差異(P>0.05)。體高和十字部寬在處理間沒有顯著差異(P>0.05)，并且日齡與處理之間不存在交互作用(P=0.152 5，P=0.405 4)。5日齡時MR處理犢牛胸圍顯著高于SAG處理(P<0.05)，但到56日齡時SAG處理顯著高于MR處理(P<0.05)。5日齡時，MR處理犢牛十字部高顯著高于RES處理(P<0.05)，但是隨著日齡增加，各處理之間差異消失(P>0.05)。胸圍和十字部高增長

方面，RES和SAG處理均顯著高于MR處理(P<0.005)。

RES和SAG對犢牛腹瀉狀況的影響見表3。3個處理腹瀉率之間沒有顯著差異(P>0.05)，但是各處理均顯示出隨著日齡增加而降低的趨勢。此外，從數(shù)值上看，與MR處理相比，飼糧添加SAG使5～56日齡腹瀉率降低了14.97%。

表2 RES和SAG對犢牛生長性能的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

表3 RES和SAG對犢牛腹瀉率的影響

2.2 RES和SAG對犢牛血清指標(biāo)的影響

RES和SAG對犢牛血清指標(biāo)的影響見表4和表5。血清營養(yǎng)物質(zhì)代謝以及內(nèi)分泌指標(biāo)中，添加RES和SAG，犢牛血清FFA濃度顯著低于MR處理(P<0.05)。RES處理犢牛血清GH、EGF和IGF-Ⅰ濃度顯著高于其余2個處理(P<0.05)。血

清免疫指標(biāo)中，RES處理血清IgA濃度顯著低于MR處理(P<0.05)。血清抗氧化指標(biāo)中，SAG處理血清MDA濃度顯著高于其余2個處理(P<0.05)。其余血清指標(biāo)各處理之間沒有顯著差異(P>0.05)。

表5 RES和SAG對犢牛血清免疫和抗氧化指標(biāo)的影響

3 討 論

3.1 RES和SAG對犢牛生長性能以及健康狀況的影響

56日齡試驗結(jié)束時，RES和SAG使總增重提高了1 kg以上，但是各處理間差異沒有達(dá)到顯著差異水平。這與楊春濤[25]在飼糧中添加桑葉黃酮，對犢牛在56日齡斷奶時ADG影響不顯著的結(jié)論一致。此外，添加RES對犢牛的DMI無顯著影響，這與Sahin等[19]觀察到添加RES后鵪鶉DMI無顯著變化的結(jié)果一致。研究顯示，添加SAG顯著增加了雞ADG，提高了飼料利用效率[18,21]，但不影響DMI[18]，這與本試驗結(jié)果一致。添加RES或SAG不影響犢牛DMI，說明這2種提取物對飼糧的適口性沒有影響。此外，飼糧中添加SAG或其類似物，顯著提高斷奶仔豬[22]和鯉魚[20]的生長性能，尤其是顯著提高斷奶仔豬的體重ADG，這與本試驗結(jié)果不一致。一般在應(yīng)激條件下，畜禽生長性能會降低，但是有研究證實在熱應(yīng)激條件下，添加SAG或者類似物能夠提高綿羊的生長性能[14]。盡管在3個處理中總增重和各日齡體重沒有顯著差異，SAG處理犢牛56日齡的胸圍顯著高于MR處理，此外，胸圍和十字部高增長方面，RES和SAG處理犢牛均顯著高于MR處理。這個結(jié)果可能是由于添加SAG提高了小腸中非氨氮的供應(yīng)量，進(jìn)而在瘤胃中飼料蛋白質(zhì)降解減少以及微生物蛋白質(zhì)合成增加。即使SAG在體內(nèi)對瘤胃微生物的影響沒有評估，肽降解和氨基酸脫氨基的減少可歸因于SAG的選擇性抗微生物作用[26]。SAG可能通過抑制芳香族氨基酸脫羧酶影響高產(chǎn)氨細(xì)菌。而微生物蛋白質(zhì)合成的增加可能是添加SAG后降低或從瘤胃中去除原生動物的反映[14]。最終使得更多的營養(yǎng)物質(zhì)用于四肢骨骼發(fā)育，這也為奶牛成年后具有優(yōu)秀性能奠定了一定的基礎(chǔ)。

腹瀉是哺乳期犢牛常發(fā)疾病之一，多見于3周齡內(nèi)的犢牛，是影響犢牛生長發(fā)育的一個重要因素[27]。本試驗結(jié)果表明，隨著犢牛日齡增加，腹瀉率有降低的趨勢，這與董曉麗[28]和楊春濤[25]的研究結(jié)果一致。隨著日齡增加，動物消化器官和免疫機能逐漸發(fā)育成熟，腹瀉率降低[29]。飼糧中添加SAG和RES雖說沒有顯著降低犢牛的腹瀉率，但是也有降低的趨勢。報道顯示，一些植物提取物對有害化合物(如霉菌毒素)有抗性[30]。因此，植物提取物可能有助于改善消化過程，最終使動物表現(xiàn)出較高的生長性能，尤其是在生命的早期階段[31]。此外，植物提取物可通過增強內(nèi)源性酶分泌，改善腸道環(huán)境和微生物群落平衡以及增強肝臟功能，來更好地利用脂肪和蛋白質(zhì)來影響動物健康[1]。SAG具有抗菌和抗炎作用，它可有效緩解斷奶仔豬斷奶應(yīng)激，保障腸道健康，降低仔豬腹瀉率發(fā)生[32]。

3.2 RES和SAG對犢牛血清指標(biāo)的影響

動物主要的血清學(xué)指標(biāo)有助于評價機體的物質(zhì)代謝及相關(guān)器官的健康狀況，為預(yù)防和治療動物疾病起指導(dǎo)作用[33]。RES和SAG對犢牛血清學(xué)指標(biāo)影響還沒進(jìn)行廣泛的研究，但是在本試驗條件下對犢牛血清指標(biāo)是有影響的。血清UN是動物機體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝的一種產(chǎn)物，可用作蛋白質(zhì)代謝和動物膳食氨基酸平衡的的一個重要指標(biāo)[34]。本試驗中，犢牛飼糧中添加RES和SAG對血清UN的濃度沒有顯著影響，這與Vakili等[35]的研究結(jié)果一致。也有研究表明，飼糧中添加植物精油引會起動物血清UN濃度的顯著變化[36-37]。本試驗出現(xiàn)的這種結(jié)果可能是因為處理間動物攝入的蛋白質(zhì)水平?jīng)]有差異造成的。

血清FFA是動物機體中重要的能量物質(zhì)，其代謝可以敏感地反映脂質(zhì)代謝，其濃度變化反映身體的營養(yǎng)狀況[38]。在本試驗中，添加SAG和RES后顯著降低血清FFA濃度。這與Rivera等[39]的結(jié)論一致，該研究在肥胖Zucker大鼠上發(fā)現(xiàn)，添加RES導(dǎo)致血清FFA濃度顯著降低。另一研究表明，在1歲齡閹牛飼糧中添加肉桂醛，與對照組相比，肉桂醛處理顯著降低血清FFA濃度。經(jīng)推測，添加肉桂醛后盡管沒有帶來ADG的差異，但是有利于閹牛的機體能量平衡；對血清FFA濃度的影響歸因于添加肉桂醛可能是通過增加DMI為動物提供了更多能量[40]。

INS是控制動物機體營養(yǎng)代謝的最重要的激素之一[41]。血液中FFA和酮體濃度顯著增加，刺激β細(xì)胞釋放INS，這可能是以防止脂肪過度動員的反饋機制。在一項對反芻動物脂質(zhì)代謝的研究中，對成熟薩?？四秆蚬嘧NS，發(fā)揮了脂質(zhì)生成作用[42]。另一項研究表明，INS通過降低腺苷酸環(huán)化酶和激素敏感性脂肪酶的活性來抑制糖異生和減弱脂肪細(xì)胞脂肪分解的功能[43]。上述反應(yīng)導(dǎo)致血清葡萄糖和非酯化脂肪酸濃度降低[44]。此外，另一關(guān)于RES對正常、高INS血癥和糖尿病大鼠血清INS濃度的影響的研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)果取決于試驗條件[45]。給正常大鼠按照每千克體重50 mg RES的劑量灌胃，30 min后減少血液INS濃度[46]，這與本次試驗的結(jié)果一致。然而，長期使用RES對正常大鼠血漿INS濃度的影響可以忽略不計[45]，與本試驗結(jié)果不同，這可能與試驗動物不同有關(guān)。

GH是垂體前葉分泌的蛋白質(zhì)，具有促進(jìn)生長的作用[47]。本試驗結(jié)果顯示，處理對總增重?zé)o顯著性影響，然而，從數(shù)值上看，與MR處理相比，RES和SAG處理的犢牛總增重要高。IGF-Ⅰ是一類多功能的細(xì)胞增殖調(diào)控因子，作為GH產(chǎn)生生理作用過程中必需的一種活性蛋白質(zhì)多肽物質(zhì)[48]。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RES處理血清GH、EGF和IGF-Ⅰ濃度顯著高于其余2個處理。這可能是因為白藜蘆醇是有效的植物雌激素[49]，通過上調(diào)EGF及其受體，激活磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)胃腸道上皮細(xì)胞的增殖與分化，修復(fù)受損的黏膜，具有提高營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收作用[50]。

通過腹瀉率可以直接觀察到犢牛健康狀況，而血清免疫球蛋白作為一種隱性指標(biāo)可以從機體內(nèi)部評價動物免疫能力，兩者合理結(jié)合有助于全面分析試驗結(jié)果[25]。研究表明，健康犢牛血清中免疫球蛋白濃度明顯高于腹瀉犢牛[51]。本試驗結(jié)果表明，MR處理犢牛血清IgA濃度顯著高于RES處理，這也可能是MR處理犢牛的腹瀉率和總增重和另外2個處理沒有顯著差異的原因。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加RES和SAG對犢牛的免疫指標(biāo)沒有顯著影響。

近年來，對動物生長性能與血液抗氧化指標(biāo)之間聯(lián)系的研究很多，認(rèn)為血清SOD或GSH-Px活性及MDA濃度分別是評價動物抗氧化狀態(tài)的正負(fù)指標(biāo)[11]。MDA作為脂質(zhì)過氧化物的代謝產(chǎn)物，主要由于細(xì)胞膜上多不飽和脂肪酸受自由基攻擊產(chǎn)生，其濃度間接反映了細(xì)胞膜受損傷的程度。從本試驗結(jié)果可以看出，SAG處理血清MDA濃度顯著高于其余2個處理，這與Lee等[21]在肉雞上添加SAG降低肉雞腿肌中的MDA濃度的結(jié)論不一致。這可能是由于動物品種和添加量不一致造成的。與Sahin等[19]在鵪鶉基礎(chǔ)飼糧中添加400 mg/kg RES時，顯著降低鵪鶉血清中MDA的濃度的結(jié)論不一致。此外，這也表明RES的抗氧化性能要優(yōu)于SAG。

4 結(jié) 論

① RES和SAG能夠顯著增加犢牛的胸圍和十字部高，有促進(jìn)犢牛采食的趨勢。

② RES和SAG對犢牛血清主要免疫指標(biāo)和抗氧化酶活性的影響不顯著。

③ RES有增加犢牛血清GH、EGF、IGF-Ⅰ濃度的作用。

④ RES和SAG有作為生長促進(jìn)劑的潛質(zhì)。

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