苘麻葉總鞣質(zhì)的提取工藝及抗氧化活性研究

楊 杰 陳曉云 郭玉茹 高 翔 田春蓮 劉明春

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽(yáng) 110866)

苘麻(AbutilontheophrastiMedic.)為錦葵科苘麻屬植物苘麻的全草或葉[1]，具有清熱利濕，解毒開(kāi)竅之功效，常用于痢疾、中耳炎、耳鳴、耳聾、化膿性扁桃體炎和癰疽腫毒等疾病的治療。苘麻中含有黃酮、多酚、鞣質(zhì)、有機(jī)酸等化學(xué)成分。目前關(guān)于苘麻黃酮和多酚的研究較多，但鞣質(zhì)的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。鞣質(zhì)類(lèi)成分具有較好的收斂作用，可以用于潰瘍、腹瀉、創(chuàng)傷、灼傷等的治療[2]。此外，鞣質(zhì)還有局部止血、抑菌抗炎、抗病毒、抗氧化、抗變態(tài)反應(yīng)、抗炎、驅(qū)蟲(chóng)、降血壓等作用[3-8]。近年來(lái)，隨著畜牧業(yè)集約化和規(guī)模化的發(fā)展，氧化應(yīng)激給畜禽帶來(lái)的危害日益嚴(yán)重[9]；此外，隨著人工合成抗氧化劑副作用報(bào)道的不斷增加，天然抗氧劑逐漸引起了相關(guān)研究者的關(guān)注。本試驗(yàn)以苘麻葉為研究對(duì)象，采用超聲波輔助提取方法結(jié)合單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)考察了總鞣質(zhì)的提取工藝，并評(píng)價(jià)了其抗氧化活性，以期為天然抗氧劑的研究和開(kāi)發(fā)奠定一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

苘麻葉采收自吉林省通榆縣開(kāi)通鎮(zhèn)，采收后清洗干凈，置陰涼處自然干燥，保存?zhèn)溆谩?/p>

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所(批號(hào)：110831—200302)。

鎢酸鈉購(gòu)于天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；鉬酸鈉、硫酸鋰購(gòu)自天津市博迪化工股份有限公司；干酪素購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其他分析試劑購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品溶液的制備

精確稱(chēng)取藥材粉末0.5 g置于100 mL三角瓶中，加入溶劑，與樣本混合；不同條件下超聲提取；冷卻靜置(每個(gè)樣品提取2次)，過(guò)濾，合并2次濾液，離心，濃縮至近干，加水溶解并稀釋至10 mL。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)考察提取時(shí)間、液料比和丙酮濃度3個(gè)因素對(duì)苘麻葉總鞣質(zhì)提取效果的影響，以苘麻葉總鞣質(zhì)提取率為考察指標(biāo)，分別考察3個(gè)因素的不同水平。各因素的考察水平如下：提取時(shí)間(10、15、20、25、30 min)、液料比(10.00、15.00、20.00、25.00、30.00 mL/g)、丙酮濃度(20%、40%、60%、80%、100%)[10]。考察任一因素對(duì)苘麻葉總鞣質(zhì)提取率的影響時(shí)，其他2個(gè)因素置于中間水平(提取時(shí)間20 min、液料比20.00 mL/g、丙酮濃度60%)，每個(gè)試驗(yàn)平行3次。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Design expert 8.0統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析。根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取丙酮濃度(A)、液料比(B)和提取時(shí)間(C)3個(gè)因素為自變量，以苘麻葉總鞣質(zhì)提取率為考察指標(biāo)。

1.2.4 苘麻葉總鞣質(zhì)的含量測(cè)定

1.2.4.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

參考《中華人民共和國(guó)獸藥典》附錄135《鞣質(zhì)含量測(cè)定法》[11]，配制0.05 mg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液，并繪制吸光度(A)與濃度(c)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到以下回歸方程：

A=0.170 9c+0.001 1(r=0.999 9)。

結(jié)果表明，鞣質(zhì)在1～10 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

1.2.4.2 鞣質(zhì)的含量測(cè)定

參考《中華人民共和國(guó)獸藥典》附錄135《鞣質(zhì)含量測(cè)定法》[11]，按照以下公式計(jì)算苘麻葉總鞣質(zhì)含量：

苘麻葉總鞣質(zhì)含量=總酚量-不被吸附的多酚量。

1.2.5 苘麻葉總鞣質(zhì)體外抗氧化試驗(yàn)

1.2.5.1 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力測(cè)定

參考Tian等[12]的方法，同時(shí)做適當(dāng)?shù)男薷?，?17 nm處測(cè)定其吸光度值，同時(shí)取100 μL蒸餾水，加900 μL DPPH工作液，37 ℃混勻，避光反應(yīng)30 min，517 nm處測(cè)定其吸光度值。同時(shí)以2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)作為陽(yáng)性對(duì)照，按照以下公式計(jì)算自由基清除率：

清除率(%)=[1-(AS-A0)/AC]×100。

式中：AS為待測(cè)樣本吸光值，A0為空白樣本吸光值，AC為DPPH工作液吸光值，清除率越大表明抗氧化能力越強(qiáng)。

清除率達(dá)50%時(shí)的DPPH自由基濃度為DPPH自由基半數(shù)清除濃度(IC50DPPH)。

1.2.5.2 2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)自由基清除能力測(cè)定

參考Tian等[12]的方法，在734 nm處測(cè)定其吸光度值；同時(shí)精確量取100 μL蒸餾水，加入900 μL ABTS工作液，室溫下避光反應(yīng)30 min，734 nm處測(cè)定其吸光度值，同時(shí)以BHT作為陽(yáng)性對(duì)照，自由基清除率計(jì)算方法及公式參考1.2.5.1。清除率達(dá)50%時(shí)的ABTS自由基濃度為ABTS自由基半數(shù)清除濃度(IC50ABTS)。

1.2.5.3 鐵離子還原/抗氧化能力(FRAP)的測(cè)定

參考Olszowy等[13]的方法，于593 nm 處測(cè)定吸光度值。FRAP以每1 μg/mL樣品達(dá)到同樣吸光度值所需的硫酸亞鐵(FeSO4)的物質(zhì)的量[mmol/(μg·mL)]表示，樣品的FRAP越大表示其抗氧化活性越高。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Design expert 8.0軟件分析響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)；采用SPSS 17.0軟件中的方差分析(ANOVA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 丙酮濃度對(duì)苘麻葉總鞣質(zhì)提取率的影響

由圖1可以看出，隨著丙酮濃度的提高，苘麻葉總鞣質(zhì)的提取率增加，當(dāng)丙酮濃度為80%時(shí)，總鞣質(zhì)的提取率最高，繼續(xù)提高丙酮的濃度，提取率反而下降。故丙酮濃度選擇80%較為理想。

2.1.2 液料比對(duì)苘麻葉總鞣質(zhì)提取率的影響

由圖1可以看出，隨著液料比的增加，苘麻葉總鞣質(zhì)提取率隨之上升，當(dāng)液料比為15.00 mL/g時(shí)總鞣質(zhì)提取率最高，液料比繼續(xù)增加時(shí)總鞣質(zhì)提取率轉(zhuǎn)而下降。因此，液料比選擇15.00 mL/g較為適宜。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)苘麻葉總鞣質(zhì)提取率的影響

由圖1可以看出，隨著超聲時(shí)間的增加，苘麻葉總鞣質(zhì)提取率逐漸上升，超聲時(shí)間為 15 min 時(shí)總鞣質(zhì)提取率最高，之后總鞣質(zhì)提取率隨超聲時(shí)間的增加反而下降。因此，超聲時(shí)間選擇15 min較合適。

丙酮濃度橫坐標(biāo)1、2、3、4、5分別為20%、40%、60%、80%、100%；液料比橫坐標(biāo)1、2、3、4、5分別為10.00、15.00、20.00、25.00、30.00 mL/g；提取時(shí)間橫坐標(biāo)1、2、3、4、5分別為10、15、20、25、30 min。

Numbers 1, 2, 3, 4 and 5 in abscissa for concentration of acetone solution represented 20%, 40%, 60%, 80% and 100%， those for ratio of solvent to material represented 10.00, 15.00, 20.00, 25.00 and 30.00 mL/g, and those for extraction time represented 10， 15， 20， 25 and 30 min.

圖1丙酮濃度、液料比和提取時(shí)間對(duì)苘麻葉總鞣質(zhì)提取率的影響

Fig.1 Effects of concentration of acetone solution, ratio of solvent to material and extraction time on the yield of TTE fromAbutilontheophrastiMedic. leaves

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Design expert 8.0統(tǒng)計(jì)軟件，根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取丙酮濃度、液料比和提取時(shí)間3個(gè)因素為自變量，丙酮

濃度分別為70%、80%、90%，料液比分別為10、15、20 mL/g，提取時(shí)間分別為10、15、20 min。以苘麻葉總鞣質(zhì)提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析。利用Design expert 8.0軟件得出的試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值見(jiàn)表1。

利用Design expert 8.0軟件對(duì)表1中試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，各因素經(jīng)回歸擬合后，獲得以苘麻葉總鞣質(zhì)提取率為目標(biāo)函數(shù)Y的二次多項(xiàng)回歸方程如下：

Y(%)=1.07-0.15A+0.022B+0.040C-0.005AB+ 0.015AC+0.01BC+0.29A2-0.38B2+0.18C2。

式中：A為丙酮濃度(%)；B為液料比(mL/g)；C為提取時(shí)間(min)。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值

續(xù)表1試驗(yàn)號(hào) Test No.自變量水平 Independent variable levelsABC響應(yīng)值 Response118015151.08129015101.38137015201.75149010150.81159015201.43168020100.85178015151.07

A：丙酮濃度 concentration of acetone solution(%)；B：液料比 ratio of solvent to material(mL/g)；C：提取時(shí)間 extraction time(min)。表2同 The same as Table 2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析

P<0.05表示作用顯著,P<0.01為作用極顯著。

P<0.05 indicates significant effect, andP<0.01 indicates extremely significant effect.

采用Design expert 8.0軟件繪制所得響應(yīng)面和等高線圖。由圖2-Ⅰ可以看出，在提取時(shí)間一定的條件下，當(dāng)丙酮濃度保持不變時(shí)，提取率隨著液料比的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在液料比15.50 mL/g時(shí)達(dá)到最大值；當(dāng)液料比不變時(shí)，提取率隨丙酮濃度增加先降低后升高，在丙酮濃度70%時(shí)達(dá)到最大值。但丙酮濃度與液料比的交互作用對(duì)提取率影響不顯著(P>0.05)。由圖2-Ⅱ可以看出，在液料比一定的條件下，當(dāng)丙酮濃度保持不變時(shí)，提取率隨著提取時(shí)間的增長(zhǎng)先下降后升高，在提取時(shí)間20 min時(shí)達(dá)到最大值；提取時(shí)間不變時(shí)，提取率隨丙酮濃度增加先降低后上升，在丙酮濃度72%時(shí)達(dá)到最大值。不過(guò)由于等高線比較平緩，丙酮濃度與提取時(shí)間的交互作用對(duì)提取率影響顯著性較低(P<0.05)。由圖2-Ⅲ可以看出，當(dāng)丙酮濃度保持不變時(shí)，若液料比一定，提取率隨著提取時(shí)間的增長(zhǎng)呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，在提取時(shí)間20 min時(shí)達(dá)到最大值；若提取時(shí)間一定，提取率隨丙酮濃度增加先上升后降低，在液料比15.00 mL/g時(shí)達(dá)到最大值。但液料比與提取時(shí)間的交互作用對(duì)提取率影響不顯著(P>0.05)。

A：丙酮濃度concentration of acetone solution(%) ；B：液料比 ratio of solvent to material(mL/g) ；C：提取時(shí)間 extractiontime(min) 。

圖2丙酮濃度與液料比(Ⅰ)、丙酮濃度與提取時(shí)間(Ⅱ)及液料比與提取時(shí)間(Ⅲ)對(duì)苘麻葉總鞣質(zhì)提取率的交互作用

Fig.2 Interation of ratio of concentration of acetone solution and ratio of solvent to material (Ⅰ), concentration of acetone solution and extraction time (Ⅱ), and solvent to material and extraction time (Ⅲ) on the yield of TTE fromAbutilontheophrastiMedic. leaves

2.3 最佳工藝條件的確定與驗(yàn)證

由Design expert 8.0軟件確定的苘麻葉總鞣質(zhì)最優(yōu)提取工藝為：丙酮濃度70%，液料比15.25 mL/g，提取時(shí)間20 min，模型預(yù)測(cè)的提取率為1.76‰。為了驗(yàn)證上述模擬最佳試驗(yàn)方案的準(zhǔn)確性和提高試驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，將上述得到的最佳處理組合進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，平行3次，平均提取率為1.77‰，實(shí)際值與預(yù)測(cè)值的偏差為0.568%，表明其相關(guān)性良好，說(shuō)明對(duì)苘麻葉總鞣質(zhì)的提取進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化合理可行。在最佳工藝條件下，同年8月份、9月份和10月份采收的苘麻葉總鞣質(zhì)的含量分別為(1.41±0.05)‰、(1.77±0.03)‰和(1.49±0.03)‰。

2.4 抗氧化試驗(yàn)

苘麻葉總多酚、不被吸附的多酚、總鞣質(zhì)含量及其抗氧化試驗(yàn)結(jié)果分別見(jiàn)表3。由表可知，8月份、9月份、10月份采收的苘麻葉總鞣質(zhì)IC50ABTS分別為0.84、0.51、0.35 μg/mL，均低于BHT陽(yáng)性對(duì)照的2.25 μg/mL；同時(shí)，DPPH清除試驗(yàn)和FRAP試驗(yàn)結(jié)果表明，3個(gè)月份采收的苘麻葉總鞣質(zhì)的IC50DPPH均低于BHT陽(yáng)性對(duì)照，F(xiàn)RAP均高于BHT陽(yáng)性對(duì)照。此外，苘麻葉總多酚和不被吸附的多酚的抗氧化活性也較為理想。結(jié)果提示，苘麻葉總多酚、不被吸附的多酚和總鞣質(zhì)均具有較好的抗氧化活性，并且在不同時(shí)間采收其抗氧化活性不同，可能與其化學(xué)成分種類(lèi)和含量有關(guān)，需待今后的試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.5 總鞣質(zhì)含量與氧化活性的相關(guān)性分析

由表4可以看出，苘麻葉中總多酚的含量與DPPH法測(cè)定其抗氧化活性的相關(guān)性顯著(P<0.05)。由表5可以看出，苘麻葉中不被吸附的多酚含量與FRAP法檢測(cè)其抗氧化活性的相關(guān)性極顯著(P<0.01)。由表6可以看出，苘麻葉中總鞣質(zhì)的粗提物含量與不同方法測(cè)定的抗氧化活性的相關(guān)性大小為FRAP>ABTS>DPPH，總鞣質(zhì)含量與不同方法測(cè)定的抗氧化活性的相關(guān)性大小為DPPH>ABTS>FRAP。結(jié)果提示，不同種類(lèi)化合物的抗氧化活性不同，對(duì)不同自由基的清除能力或還原能力所有差別。因此，為了客觀正確的評(píng)價(jià)抗氧化活性，要同時(shí)選擇多種抗氧化活性測(cè)定方法。

表3 苘麻葉總多酚、不被吸附的多酚和總鞣質(zhì)含量及其抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

表4 苘麻葉中總多酚含量與不同方法測(cè)定的抗氧化活性的相關(guān)性

ABTS:2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽；DPPH:1,1-二苯基-2-三硝基苯肼；FRAP:鐵離子還原/抗氧化能力。*表示顯著相關(guān)(P<0.05)，**表示極顯著相關(guān)(P<0.01)。下表同。

ABTS:2,2′-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)； DPPH: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl； FRAP: ferric ion reducing antioxidant power. * means significant correlation (P<0.05), and ** means extremely significant correlation (P<0.01). The same as below.

3 討 論

3.1 苘麻葉總鞣質(zhì)提取工藝的優(yōu)化

鞣質(zhì)類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)中具有較多的羥基，穩(wěn)定性較差，且其分子質(zhì)量較大，給提取分離工作帶來(lái)了一定的難度。因此，優(yōu)化鞣質(zhì)的提取工藝對(duì)實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用具有重要指導(dǎo)意義[14]。本研究采取單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)合超聲提取的方法優(yōu)化了苘麻葉總鞣質(zhì)的提取工藝，并獲得了最佳提取工藝。

表5 苘麻葉中不被吸附多酚含量和不同方法測(cè)定的抗氧化活性的相關(guān)性

表6 苘麻葉中總鞣質(zhì)含量與不同方法測(cè)定的抗氧化活性的相關(guān)性

3.2 苘麻葉總鞣質(zhì)體外抗氧化活性研究

鞣質(zhì)由于具有較多的酚羥基，故具有較好的清除自由基功能[15]。本試驗(yàn)采用DPPH自由基清除法、ABTS自由基清除法、FRAP測(cè)定法檢測(cè)苘麻葉總多酚、不被吸附的多酚和總鞣質(zhì)體外抗氧化水平，結(jié)果顯示三者均具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

3.3 苘麻葉總鞣質(zhì)的含量和抗氧化活性與采收時(shí)間的關(guān)系

研究表明，中藥在不同時(shí)間采收直接影響其中的活性物質(zhì)的產(chǎn)量、品質(zhì)和提取率[16]。本試驗(yàn)對(duì)相同年份不同月份的苘麻葉總鞣質(zhì)進(jìn)行了提取，并考察了其體外抗氧化水平，結(jié)果顯示，同年不同月份采收的苘麻葉總鞣質(zhì)含量高低次序是9月份>10月份>8月份。ABTS自由基清除法和FRAP測(cè)定法測(cè)定結(jié)果揭示8月份、9月份、10月份的苘麻葉總鞣質(zhì)抗氧化活性逐漸增強(qiáng)，DPPH自由基清除試驗(yàn)結(jié)果則顯示不同月份苘麻葉總鞣質(zhì)的抗氧化活性次序是9月份>10月份>8月份。故應(yīng)根據(jù)具體用途，選擇苘麻葉的最佳采收時(shí)間。

4 結(jié) 論

① 本試驗(yàn)建立的苘麻葉總鞣質(zhì)最佳提取工藝條件為：丙酮濃度70%、液料比15.25 mL/g、提取時(shí)間20 min。在此條件下，8月份、9月份和10月份采收的苘麻葉總鞣質(zhì)的含量分別為(1.41±0.05)‰、(1.77±0.03)‰和(1.49±0.03)‰。

② DPPH自由基清除法、ABTS自由基清除法、FRAP測(cè)定法等體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明，苘麻葉總鞣質(zhì)具有良好的抗氧化活性。

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