響應(yīng)面試驗優(yōu)化中式香腸天然復(fù)合抗氧化劑的配方

羅愛國，胡變芳

1(山西藥科職業(yè)學(xué)院 食品工程系，山西 太原，030031) 2(晉中學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山西 晉中，030619)

中式香腸是我國消費者最受歡迎的肉制品之一，但因其脂肪含量一般≥20%，易發(fā)生脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生異味而影響香腸品質(zhì)及消費，尤其是在高溫(45～60 ℃)干燥條件下[1-2]。在工業(yè)生產(chǎn)中主要通過添加合成抗氧化劑來減小脂質(zhì)過氧化，以改善香腸品質(zhì)以及延長貨架期。隨著越來越多消費者對合成抗氧化劑(如丁基羥基茴香醚、二丁基羥基甲苯等)安全問題的擔憂，天然抗氧化劑替代合成抗氧化劑應(yīng)用于食品工業(yè)已成為研究熱點[3]。但單一的天然抗氧化劑的效果弱、效率低[4-5]，而抗氧化活性成分間復(fù)配的協(xié)同增效作用可有效提高抗氧化能力[6-7]。

花椒葉為蕓香科植物花椒的葉子，富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、膳食纖維、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，是一種傳統(tǒng)的純天然食品[8]；且花椒葉含有抗氧化活性成分如黃酮、多酚、揮發(fā)油等[9-10]，LI等[11]發(fā)現(xiàn)花椒葉提取物可抑制腌制和干制銀鯉腌的脂質(zhì)氧化。前期我們的研究也證實了花椒葉提取物能夠減緩食用油脂氧化，且與Vc具有協(xié)同增效作用[12]?；ń啡~提取物具有抗氧化活性，能夠用于食品保鮮。

迷迭香提取物、抗壞血酸(Vc)是我國肉制品中允許使用的天然抗氧化劑。關(guān)于花椒葉提取物與迷迭香的協(xié)同作用以及Vc、花椒葉提取物與迷迭香提取物三者復(fù)合抗氧化作用的研究均未見報道。

本研究主要采用Central Composite試驗設(shè)計，以硫代巴比妥酸值(TBARS值)為響應(yīng)值，考察了花椒葉提取物、迷迭香提取物以及Vc復(fù)合抗氧化劑在中式香腸中的保鮮效果，并優(yōu)化復(fù)合抗氧化劑的配比，以期為中式香腸保鮮開發(fā)一種天然高效的食品抗氧化劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花椒葉，采集于山西省陽泉市盂縣；迷迭香提取物(質(zhì)量分數(shù)：鼠尾草酚3.3%、鼠尾草酸5.3%、迷迭香酸5.5%)，南京澤朗醫(yī)藥公司；Vc(質(zhì)量分數(shù)：99%)，東北制藥集團股份有限公司；95%體積分數(shù)食用乙醇(食品級)，常州啟迪化工有限公司；硫代巴比妥酸(TBA)，上?？曝S化學(xué)試劑有限公司；1，1，3，3-四乙氧基丙烷(標準品)，武漢天植生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋(HH-2型)，常州國華電器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-52AA型)，上海亞榮生化儀器廠；冷凍干燥機(FreeZone型)，美國Labconco公司；絞肉機(SZ-12型)，中國杭州賽旭食品機械有限公司；高速斬拌機(SZ-80型)，中國杭州賽旭食品機械有限公司；紫外可見分光光度計(TU-1810)，北京普板通用有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 花椒葉提取物的制備

采集的花椒葉用蒸餾水清洗后，經(jīng)40 ℃真空干燥1 h，粉碎后過40目篩，經(jīng)真空包裝后4 ℃冷藏備用?；ń啡~提取物的制備依據(jù)羅愛國等[12]方法，并稍作修改。 20 g花椒葉粉末與200 mL體積分數(shù)為65%食用乙醇溶液混合于圓底燒瓶，60 ℃回流提取10 min，經(jīng)減壓抽濾后得濾液；濾渣經(jīng)100 mL的體積分數(shù)為65% 食用乙醇按上述方式再次回流提取，合并2次濾液得到花椒葉乙醇提取液。乙醇提取液在60 ℃下減壓濃縮到約20 mL，經(jīng)真空冷凍干燥(真空度10 Pa, 冷阱溫度為-82 ℃)，得花椒葉提取物干粉(產(chǎn)率為84.5 mg/g)，經(jīng)真空包裝后4 ℃冷藏備用。

1.3.2 中式香腸的生產(chǎn)工藝

參照YU等[13]的工藝制作，新鮮無骨冷鮮豬肉(去皮、結(jié)締組織、脂肪)和背脂分別被絞成5 mm肉末，根據(jù)表1配方制作香腸。香腸原材料被高速均質(zhì)15 min，然后將香腸原料混合物分成若干份(約100 g/份)，分別將花椒葉提取物、迷迭香提取物及Vc按不同配比復(fù)合成抗氧化劑以隨機方式添加到香腸原料混合物中，將混合物高速斬拌30 min后，灌入豬腸衣，隔3 cm刺孔放氣，并結(jié)扎制成直徑(35±2) mm、長約為15 cm的香腸。將制好的香腸在50 ℃中烘烤48 h，然后在15 ℃車間晾掛熟化20 d，經(jīng)真空包裝、貼標，在室溫下貯藏。以未添加抗氧化劑的香腸為對照，在貯藏期取香腸樣品測定硫代巴比妥酸值(TBARS)及進行感觀評價。所有試驗在不同的時間重復(fù)3次。

表1 中式香腸配方Table 1 Formulation of Chinese-style pork sausages

1.3.3 TBARS值測定

TBARS值采用趙建生等[14]的方法。取10.0 g香腸樣品，加入50 mL三氯乙酸混合溶液，均質(zhì)3 min，真空抽濾后，移取5.00 mL濾液于具塞比色管中，加入5 mL TBA溶液，在90 ℃水浴中加熱40 min，冷卻至室溫后在12 000 r/min下離心5 min，取上清液加入5 mL三氯甲烷，搖勻，待靜置分層后，用紫外分光光度計測定上清液在波長538 nm處的吸光度值，同時做空白試驗。

用1，1，3，3-四乙氧基丙烷配制丙二醛標準溶液，按上述方法測定并繪制丙二醛標準曲線。

1.3.4 感觀分析

感官分析采用ZHANG等[2]的方法。感官評定小組由10名食品專業(yè)的教師與學(xué)生組成，并在評價前根據(jù)我國肉制品感觀評價標準(GB/T 22210—2008)進了專業(yè)培訓(xùn)。香腸樣品經(jīng)蒸煮15 min，取出冷卻到溫室，切成3 mm厚片，放在標有隨機數(shù)字的白色磁盤中，感觀評價在裝有熒光燈的獨立房間進行，每次測試時間相同。在評價不同樣品之間，評價小組成員用溫水漱口。評價方法采用9分制評分(評價標準見表2)，對香腸的感觀品質(zhì)(色澤、氣味、滋味、質(zhì)地及總體可接受性)進行評價。

表2 中式香腸感觀評價標準Table 1 Standard of sensory evaluationof Chinese-style sausages

1.3.5 天然復(fù)合抗氧化劑配比優(yōu)化試驗

1.3.5.1 單因素試驗

根據(jù)課題組前期研究[12]以及有關(guān)文獻[11, 15-16]，單因素試驗中花椒葉提取物、迷迭香提取及Vc用量分別選取0.08、0.07及0.60 g/kg。單因素試驗按照1.3.2工藝制作中式香腸，測定香腸樣品貯藏第60天的TBARS值，考察花椒葉提取物用量(0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16 g/kg)、迷迭香提取物用量(0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 g/kg)及Vc用量(0.00、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75、0.90、1.05、1.20 g/kg)對TBARS值的影響。

1.3.5.2 復(fù)合抗氧化劑配比響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素考察試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，確定各抗氧化劑用量水平，采用Central Composite設(shè)計(CCD)試驗方案，按照1.3.2工藝生產(chǎn)中式香腸，測定樣品在貯藏第60天的TBARS值。對自變量A(花椒葉提取物用量)、B(迷迭香提取用量)及C(Vc用量)與響應(yīng)值(TBARS值)關(guān)系進行二次多項式擬合回歸，建立函數(shù)關(guān)系，確定復(fù)合抗氧化劑最佳配比。

1.3.6 天然復(fù)合抗氧化劑在中式香腸中效果測定

將優(yōu)化的用量配制復(fù)合抗氧化劑，按照1.3.2工藝制作中式香腸，分別在貯藏第0、15、30、45、60、75、90、105、120天取樣測定TBARS值，并評價貯藏第60天的香腸感觀品質(zhì)。

1.3.7 統(tǒng)計方法

所有實驗重復(fù)3次。實驗結(jié)果以±SE形式表示。配方優(yōu)化采用Design-Expert 8.06軟件進行試驗設(shè)計及回歸分析，并求極值。數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進行方差分析，香腸的TBARS值及感觀評價用鄧肯多重比較來確定不同處理間的顯著性差異，以p≤0.05作為顯著性水平，以p≤0.01作為極顯著性水平；復(fù)合抗氧化劑配方驗證分析采用一般線性模型(GLM)，將處理和時間作為固定效應(yīng)，重復(fù)作為隨機效應(yīng)，進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 花椒葉提取物用量對中式香腸TBARS值的影響

固定迷迭香提取物用量為0.07 g/kg、Vc用量為0.60 g/kg，考察花椒葉提取物用量對中式香腸的TBARS值的影響，如圖1所示。

圖1 花椒葉提取物用量對中式香腸TBARS值的影響Fig.1 Effect of extract from Zanthoxylum bungeanum Maxim leaves on TBARS of Chinese-style sausage

由圖1可知，隨著花椒葉提取物用量的增加中式香腸的TBARS值逐漸降低。當花椒葉提取物用量增加至0.08 g/kg時，香腸TBARS值為0.65 mgMDA/kg；當用量繼續(xù)增加(≥0.10 g/kg)，相對應(yīng)的香腸TBARS值間無顯著性差異(p>0.05)。因此，確定花椒葉提取物最佳用量為0.08 g/kg，將此用量作為Central Composite試驗設(shè)計中該因素的零水平。

2.1.2 迷迭香提取物用量對中式香腸TBARS值的影響

固定花椒葉提取物用量為0.08 g/kg、Vc用量為0.6 g/kg，考察迷迭香提取物用量對中式香腸的TBARS值的影響，如圖2所示。

圖2 迷迭香提取物用量對中式香腸TBARS值的影響Fig.2 Effect of Rosemary extract on TBARS of Chinese- style sausage

由圖2可知，迷迭香提取物用量增加至0.06 g/kg時，香腸TBARS值為0.61 mg MDA/kg；當其用量繼續(xù)增加(≥0.08 g/kg)，相對應(yīng)的香腸TBARS值間無顯著性差異(p>0.05)。因此，確定花椒葉提取物最佳用量為0.06 g/kg，將此用量作為Central Composite試驗設(shè)計中該因素的零水平。

2.1.3 Vc用量對中式香腸TBARS值的影響

固定花椒葉提取物用量0.08 g/kg、迷迭香提取物用量0.07 g/kg，考察Vc用量對中式香腸的TBARS值的影響，如圖3所示。

圖3 Vc用量對中式香腸TBARS值的影響Fig.3 Effect of Vc on TBARS of Chinese-style sausage

由圖3可知，Vc用量增加0.45 g/kg時，香腸TBARS值為0.62 mgMDA/kg；當其用量繼續(xù)增加(≥0.60 g/kg)，相對應(yīng)的香腸TBARS值間無顯著性差異(p>0.05)。因此，確定Vc最佳用量為0.60 g/kg，將此用量作為Central Composite試驗設(shè)計中該因素的零水平。

2.2 天然復(fù)合抗氧化劑配比響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 CCD試驗設(shè)計方案及試驗結(jié)果

根據(jù)單因素考察試驗結(jié)果，確定花椒葉提取用量的零水平為0.8 g/kg，標準差為0.4；迷迭香提取物用量的零水平為0.6 g/kg，標準差為0.3；Vc用量的零水平為0.45 g/kg，標準差為0.2。抗氧化劑各因素用量范圍實際值及標準化值見表3。通過CCD試驗設(shè)計模型，采用響應(yīng)面法對復(fù)合抗氧化劑配比進行優(yōu)化，試驗方案及結(jié)果見表4。

表3 抗氧化劑各因素用量范圍實際值及標準化值Table 3 The dosage range actual value of various factorsfor antioxidants and standardized value

注：A為花椒葉提取物用量；B為迷迭香提取物用量；C為Vc用量。

表4 復(fù)合抗氧化劑配比優(yōu)化的響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Experimental design and result of the responsesurface analysis of composite antioxidant ratio optimization

注：A為花椒葉提取物用量；B為迷迭香提取物用量；C為Vc用量；Y為TBARS值。

2.2.2 回歸模型建立及方差分析

對響應(yīng)面試驗結(jié)果進行回歸擬合，得到了貯藏期中式香腸的TBARS值與各抗氧化劑用量的回歸方程：Y=0.42+0.032A+0.044B-0.023C+0.005AB-0.044AC+0.034BC+0.051A2+0.044B2+0.023C2；式中，A為花椒葉提取物用量，g/kg；B為迷迭香提取物用量，g/kg；C為Vc用量，g/kg。并對回歸方程進行了方差分析，結(jié)果見表5。模型項p≤0.000 1，說明回歸方程的關(guān)系是顯著的；失擬項p>0.05，失擬項不顯著，說明該回歸模型擬合良好，可用該模型對試驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析；調(diào)整回歸系數(shù)為R2=0.942 1，表明擬合的回歸方程能較好地反映各抗氧化劑用量與中式香腸的TBARS值之間的實際變化關(guān)系，可用來代替試驗真實點預(yù)測響應(yīng)值。

3個因素中一次項A、B、C，二次項A2、B2、C2以及交互項AC、BC對響應(yīng)值影響極顯著，AB項對響應(yīng)值影響不顯著(p≤0.05)。這表明花椒葉提取物、迷迭香提取物及Vc用量均顯著影響貯藏期中式香腸的TBARS值，由各因素的F值可知，其對TBARS值影響的主次順序為：B>A>C，即迷迭香用量>花椒葉提取物用量>Vc用量；花椒葉提取物與Vc、迷迭香提取物與Vc之間均存在顯著的協(xié)同增效作用，但花椒葉提取物與迷迭香提取物間無顯著增效作用，其影響的主次順序為：花椒葉提取物用量×Vc用量>迷迭香提取物用量×Vc用量。

表5 響應(yīng)曲面二次回歸模型的方差分析Table 5 Variance analysis of response surface quadraticregression model

2.2.3 因素間的交互效應(yīng)分析

為進一步考察因素間的交互效應(yīng)，對有關(guān)變量經(jīng)降維處理(分別將回歸方程中C、B和A項固定在零水平)，得回歸方程下如：YAB=0.42+0.032A+0.044B+0.005AB+0.051A2+0.044B2；YAC=0.42+0.032A-0.023C-0.044AC+0.051A2+0.023C2；YBC=0.42+0.044B-0.023C+0.034BC+0.044B2+0.023C2，圖4為相對應(yīng)的響應(yīng)面和等高線圖。響應(yīng)面曲線越陡峭，表明該因素對響應(yīng)值影響越大[17]，等高線圖越呈橢圓形，表明兩因素間的交互效應(yīng)越大[16]。從圖4(a1、b1及c1)的響應(yīng)面圖可直觀看出各因素對中式香腸TBARS值的影響大小，迷迭香提取物用量的影響最大，其次是花椒葉提取物，Vc的影響最小。這與回歸分析結(jié)果一致。

圖4-b2中，花椒葉提取物用量和Vc用量交互效應(yīng)的等高線呈橢圓，說明兩因素間存在明顯的交互效應(yīng)，花椒葉提取物用量為0.073 g/kg和Vc用量為0.52 g/kg時，TBARS值最小。圖4-c2中，迷迭香提取物用量和Vc用量交互效應(yīng)的等高線趨近橢圓，說明兩因素間存在交互效應(yīng)，迷迭香提取物用量為0.034 g/kg和Vc用量為0.65 g/kg時，TBARS值最??；圖4-a2花椒葉提取物用量和迷迭香提取物用量交互效應(yīng)的等高線圖近似圓形，說明兩因素間不存在顯著的交互效應(yīng)。可見花椒葉提取物與Vc、迷迭香提取物與Vc對中式香腸抗氧化作用具有明顯的增效作用。

圖4 各因素交互作用對中式香腸TBARS值影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots shows the interactive effect of three factors on TBARS of Chinese-style sausage

2.2.4 復(fù)合抗氧化劑配比優(yōu)化及效果驗證

采用Design Expert 8.0軟件對回歸函數(shù)模型進行極值分析，預(yù)測模型響應(yīng)值(TBARS)，優(yōu)化得三因素最佳組合為Z(-0.01，-0.47，0.17)，即花椒葉提取物用量為0.079 2 g/kg、迷迭香提取物用量為0.045 9 g/kg、Vc用量為0.484 g/kg，此時中式香腸樣品的TBARS最小值Y為0.398 1 mg MDA/kg。按此最優(yōu)配比進行3次重復(fù)試驗驗證，測得中式香腸貯藏60 d的實際TBARS平均值為0.403 7 mg MDA/kg，與預(yù)測值接近程度達98.61%，表明該回歸模型能夠準確預(yù)測在中式香腸中復(fù)合抗氧化劑配比情況。

2.3 復(fù)合抗氧化劑在中式香腸中的抗氧化效果

2.3.1 香腸TBARS值的變化

香腸在較高的貯藏溫度、較多的脂肪含量、光線以及體系中的促氧化成分(如調(diào)味料、活潑金屬離子等)存在下極易發(fā)生脂質(zhì)氧化。TBARS值被廣泛用來衡量肉制品脂質(zhì)氧化的程度，TBA反應(yīng)物的存在是由于脂質(zhì)的過氧化物在自氧化第二階段被氧化成醛、酮等，其中丙二醛為主要產(chǎn)物之一[18]。在本研究中復(fù)合抗氧化劑對中式香腸貯藏期TBARS值的影響見圖5。在貯藏前，對照組香腸的TBARS值為0.39 mgMDA/kg，這個值接近于YU等[13]報道的0.35 mgMDA/kg，在貯藏120 d后增加到3.38 mg MDA/kg；而添加復(fù)合抗氧化劑的中式香腸在各個測定時間點上TBARS值均顯著低于對照組(p≤0.05)。中式香腸TBARS值在貯藏期的增加表明脂質(zhì)過氧化的發(fā)生，而花椒葉復(fù)合抗氧化劑的添加能夠顯著延緩中式香腸的脂質(zhì)氧化。在相似的研究中，殷燕等[15]發(fā)現(xiàn)在豬肉餅中添加不同劑量(0.03%、0.06%和0.09%)的迷迭香提取物，其抗脂肪氧化效果顯著高于對照組(p<0.05)，效果與添加0.02%的二丁基羥基甲苯相當；顧仁勇等[16]證實了Vc(添加量0.36 g/kg)與植酸等復(fù)配添加到湘西香腸具有顯著的抗氧化性，與對照組相比有較低的POV值和TBARS值。SOJIC等[19]認為當肉制品的TBARS值> 1 mg MDA/kg時開始腐敗，在本研究中對照組香腸TBARS值在貯藏30 d 達到0.93 mg MDA/kg；而處理組的TBARS值為0.20 mg MDA/kg，直到第75天達到1.05 mg MDA/kg。據(jù)FAN等[20]報道肉制品的TBARS限值是2 mg MDA/kg，在本試驗中添加復(fù)合抗氧化劑香腸在貯藏期120 d的TBARS值(1.72 mg MDA/kg)均小于2 mg MDA/kg，而對照組香腸在貯藏60 d的TBARS值達到了2.44 mg MDA/kg。這些結(jié)果均表明，復(fù)合添加劑在中式香腸中具有顯著的抗氧化效果，能夠延長香腸的貨架期45 d以上。

圖5 復(fù)合抗氧化劑對中式香腸貯藏期的TBARS值的影響Fig.5 Effect of composite antioxidant on TBARS value of Chinese-style sausage during storage

2.3.2 香腸感觀品質(zhì)評價

感觀分析結(jié)果見表6，添加了花椒葉提取物復(fù)合抗氧化劑中式香腸在貯藏60 d的感觀屬性(色澤、氣味、滋味、質(zhì)地及總體可接受性)顯著低于對照組(p≤0.001)。由2.3.1結(jié)果可知，對照組香腸在貯藏60 d時，其TBARS值為2.44 mg MDA/kg，且各感觀指標均表明香腸已經(jīng)腐敗，故未作滋味評價。對照組香腸各感觀屬性值為4.11～4.27，表明香腸已不能被消費者接受；而添加復(fù)合抗氧化劑中式香腸感觀屬性值在6.45～6.83，各感觀屬性值均顯著高于對照組(p≤0.001)，受消費者喜愛。感觀評價結(jié)果表明復(fù)合抗氧化劑香腸處理組具有更好的感觀品質(zhì)，與香腸的TBARS值研究結(jié)果總體一致。

表6 復(fù)合抗氧化劑對中式香腸貯藏第60天的感觀品質(zhì)的影響Table 6 Effect of composite antioxidant on sensory quality of Chinese-style sausage on the 60 day

注：a-b表示同一列中的不同處理間的顯著性不同(p<0.05)；ND為未檢測。

3 結(jié)論

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