芝麻香型白酒堆積發(fā)酵對(duì)入窖發(fā)酵過程及原酒品質(zhì)的影響

李小東，高大禹，田慶貞，蔡叢菊，夏海鋒*，陳建新*

1(江南大學(xué)，糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122) 2(江蘇泰州梅蘭春酒廠有限公司，江蘇 泰州，225300)

堆積發(fā)酵作為芝麻香型白酒實(shí)際生產(chǎn)過程中不可或缺的工藝環(huán)節(jié)，其成功與否將直接影響入窖發(fā)酵的進(jìn)行，最終影響出酒率和產(chǎn)酒質(zhì)量[1]。在堆積發(fā)酵過程中，酒醅網(wǎng)羅空氣環(huán)境以及生產(chǎn)器具的微生物，利用酒醅中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)、繁殖、代謝、產(chǎn)熱[2]。在堆積發(fā)酵結(jié)束時(shí)，發(fā)酵微生物獲得大量富集、酶動(dòng)力大量積累、微生物代謝合成白酒基本風(fēng)味物質(zhì)以及芝麻香風(fēng)味成分的前體物質(zhì)[3]。

堆積發(fā)酵在開放式環(huán)境下進(jìn)行，受水分、空氣微生物、溫度以及氧氣濃度等因素的影響[4]。在堆積發(fā)酵前期，空氣流通、溫度適宜、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，各種微生物快速增殖，尤其是酵母菌和霉菌[5]。同時(shí)堆積發(fā)酵后期的高溫環(huán)境、不同部位酒醅氧氣濃度的差異、微生物之間的相互作用，使得各種微生物進(jìn)一步自然篩選，于堆積發(fā)酵結(jié)束時(shí)優(yōu)勢(shì)微生物菌群演替完成，為入窖發(fā)酵提供微生物基礎(chǔ)[6-7]。入窖發(fā)酵作為堆積發(fā)酵的延續(xù)和豐富，伴隨著窖內(nèi)微生物菌群進(jìn)一步演替以及微生物的代謝活動(dòng)，最終賦予白酒特殊的芝麻香風(fēng)味[8]。而影響窖內(nèi)微生物菌群演替及其代謝活動(dòng)的最主要因素為入窖初始微生物菌群的構(gòu)成[9]。此外，萬(wàn)清徽等[10]通過將實(shí)際生產(chǎn)中堆積結(jié)束時(shí)的表層醅和中心醅按不同比例混合后進(jìn)行對(duì)比發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)不同混合比例酒醅會(huì)產(chǎn)生不同的發(fā)酵過程軌跡，最終影響原酒的香氣品質(zhì)。因此本文通過模擬實(shí)際堆積及入窖發(fā)酵過程，研究在不同堆積溫度條件下，不同的微生物菌群演替結(jié)果(即入窖初始微生物菌群構(gòu)成)對(duì)入窖發(fā)酵過程以及原酒品質(zhì)的影響，為芝麻香型白酒發(fā)酵過程控制及優(yōu)化技術(shù)提供實(shí)踐與理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)室堆積發(fā)酵所用的高粱、小麥、麩皮、高溫曲、中溫曲，麩曲均取至江蘇泰州梅蘭春酒廠。乙酸、乳酸(色譜純)阿拉丁；青霉素、制霉菌素，生工生物工程(上海)股份有限公司；葡萄糖、氫氧化鈉、鹽酸等試劑(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜儀(1260 infinity)，Agilent；氣相色譜儀(GC-2010 Plus)，日本SHIMADZU公司；生化培養(yǎng)箱(BSP-250)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；無(wú)紙記錄儀(SIN-R200D)，溫度探頭(Ptl00)，杭州聯(lián)測(cè)自動(dòng)化技術(shù)有限公司；離心機(jī)(Pico 17)，Thermo。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)室模擬實(shí)際堆積發(fā)酵和入窖發(fā)酵

在實(shí)驗(yàn)室通過程序升溫培養(yǎng)箱進(jìn)行堆積發(fā)酵和入窖發(fā)酵。堆積發(fā)酵周期為48 h，入窖發(fā)酵周期為30 d，其中堆積發(fā)酵期間隔12 h取樣，入窖發(fā)酵前10 d，隔2 d取樣，后20 d隔4 d取樣測(cè)定指標(biāo)。堆積發(fā)酵模擬兩條溫度曲線，曲線1為酒廠夏季堆積溫度曲線，堆積頂溫達(dá)50.5 ℃，為高溫堆積。曲線2為酒廠冬季堆積溫度曲線，堆積頂溫達(dá)45.4 ℃，為低溫堆積。樣品1、2模擬溫度曲線1進(jìn)行高溫堆積，其中樣品1監(jiān)測(cè)中心部位酒醅溫度，樣品2監(jiān)測(cè)表層部位酒醅溫度。樣品3、4模擬溫度曲線2進(jìn)行低溫堆積，其中樣品3監(jiān)測(cè)中心部位酒醅溫度，樣品4監(jiān)測(cè)表層部位酒醅溫度。堆積發(fā)酵結(jié)束時(shí)，樣品1、3混勻后入窖發(fā)酵，而樣品2、4單獨(dú)取表層酒醅入窖發(fā)酵[10]。各樣品入窖發(fā)酵模擬1條溫度曲線(酒廠夏季窖池發(fā)酵溫度曲線)，發(fā)酵頂溫為41.5 ℃。堆積發(fā)酵過程中，樣品1、3均勻取樣，樣品2、4在表層部位取樣，入窖發(fā)酵過程中4個(gè)樣品均勻取樣測(cè)定指標(biāo)。堆積，入窖發(fā)酵期間使用無(wú)紙記錄儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)酒醅溫度變化。

1.3.2 酒醅微生物數(shù)量變化測(cè)定

稱取酒醅樣品10 g于90 mL無(wú)菌生理鹽水中混勻，使酒醅微生物充分洗脫于溶液中，并進(jìn)行梯度稀釋涂布于固體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，培養(yǎng)至菌落長(zhǎng)出并計(jì)數(shù)。其中酵母菌涂布于YPD固體培養(yǎng)基(添加100 mg/L青霉素)，30 ℃培養(yǎng)2 d即可計(jì)數(shù)[11]。細(xì)菌涂布于LB固體培養(yǎng)基(添加100 mg/L制霉菌素)，37 ℃培養(yǎng)1 d即可計(jì)數(shù)[11]。霉菌涂布于PDA固體培養(yǎng)基(添加100 mg/L青霉素)，30 ℃培養(yǎng)4～5 d即可計(jì)數(shù)[11]。乳酸菌涂布于MRS固體培養(yǎng)基(添加100 mg/L制霉菌素)，37 ℃培養(yǎng)2～3 d即可計(jì)數(shù)[12]。芽孢桿菌涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基(添加100 mg/L制霉菌素)，37 ℃培養(yǎng)1 d即可計(jì)數(shù)。涂布之前需將酒醅菌液放置于恒溫水浴槽中，80 ℃處理20 min，殺死其余非芽孢微生物，再進(jìn)行稀釋涂布平板培養(yǎng)[13]。

1.3.3 酒醅理化指標(biāo)測(cè)定

酒醅樣品還原糖、酸度、淀粉以及淀粉出酒率的測(cè)定采用白酒發(fā)酵酒醅分析方法[14-15]。酒精度采用GC測(cè)定[16]，乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=152 551.08x+2 765.12，R2=0.994。

1.3.4 酒醅乳酸和乙酸含量測(cè)定

采用HPLC法測(cè)定[17]。乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線：y(mg/g酒醅)=2 134.84x+160.84，R2=0.999；乙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線：y(mg/g酒醅)=2 704.36x+25.60，R2=0.999。

1.3.5 酒樣感官品評(píng)分析

最終酒樣采用暗杯盲評(píng)的方法進(jìn)行[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 堆積發(fā)酵和入窖發(fā)酵過程中溫度變化分析

如圖1所示，按方法1.3.1模擬實(shí)際堆積及入窖發(fā)酵過程且均達(dá)到預(yù)計(jì)期望。各樣品堆積發(fā)酵和入窖發(fā)酵酒醅實(shí)際溫度與設(shè)定溫度基本一致。其中在堆積發(fā)酵24 h以后，樣品2酒醅溫度略高于樣品1酒醅溫度，同樣樣品4酒醅溫度也略高于樣品3酒醅溫度?？赡苁怯捎跇悠?、4監(jiān)測(cè)表層部位酒醅溫度，樣1、3監(jiān)測(cè)中心部位酒醅溫度，而表層部位酒醅直接與空氣接觸，氧氣充足，微生物生長(zhǎng)繁殖，代謝產(chǎn)熱更為劇烈，使得酒醅溫度也偏高。

A-堆積發(fā)酵溫度變化曲線；B-入窖發(fā)酵溫度變化曲線圖1 堆積發(fā)酵和入窖發(fā)酵溫度變化曲線Fig.1 Temperature variation curve of accumulation and cellar fermentation

2.2 堆積發(fā)酵和入窖發(fā)酵過程中微生物數(shù)量變化分析

如圖2所示，在堆積發(fā)酵前24 h各樣品微生物增長(zhǎng)較緩慢，但堆積36 h時(shí)，已達(dá)到堆積頂溫，表面開始出現(xiàn)“白霜”層酒醅[18]，此時(shí)酵母菌和霉菌增長(zhǎng)最為顯著，均高于9.20 lgCFU/g。之后由于高溫環(huán)境，霉菌和酵母菌增長(zhǎng)速率明顯變緩慢。此外總細(xì)菌、芽孢桿菌、乳酸菌數(shù)量也在不斷增加，但增加趨勢(shì)較平緩。

如表1所示，樣品1、3由于堆積溫度相差5 ℃，使得入窖初始微生物數(shù)量也存在差異。其中樣品1酵母菌、芽孢桿菌數(shù)量明顯高于樣品3，霉菌、總細(xì)菌和乳酸菌數(shù)量與樣品3較接近。樣品2、4由于是表層酒醅，在整個(gè)堆積發(fā)酵過程中，氧氣充足，各種微生物大量生長(zhǎng)繁殖，其中酵母菌、霉菌數(shù)量與樣品1、3相比存在顯著差異，均高于9.04 lgCFU/g。另外總細(xì)菌、芽孢桿菌和乳酸菌數(shù)量也高于樣品1、3。因此在不同的堆積溫度條件下，微生物菌群演替過程以及入窖起始微生物數(shù)量均存在差異，且充足的氧氣可促進(jìn)微生物的增殖。

表1 入窖發(fā)酵第0天酒醅微生物數(shù)量比較Table 1 Comparison of microbial quantity of cellar fermentation on day 0

如圖2所示，酵母菌和霉菌從入窖發(fā)酵開始就處于下降趨勢(shì)，而且霉菌(好氧)下降速度高于酵母菌(兼性厭氧)。其中樣品1、3至發(fā)酵結(jié)束時(shí)酵母菌和霉菌僅剩2 lgCFU/g，而總細(xì)菌、芽孢桿菌和乳酸菌數(shù)量始終較高，但變化趨勢(shì)較平緩。樣品2、4盡管起始微生物數(shù)量遠(yuǎn)高于樣品1、3，但入窖發(fā)酵后，酵母菌下降速度與幅度均高于樣品1、3，尤其是樣品2中酵母菌下降速度基本與霉菌一致。兩樣品在發(fā)酵22 d后酵母菌已經(jīng)未能檢測(cè)到，霉菌至發(fā)酵結(jié)束時(shí)為2 lgCFU/g。相反樣品2、4中細(xì)菌、芽孢桿菌、乳酸菌數(shù)量始終高于樣品1、3。因此入窖起始微生物數(shù)量的差異，直接影響各種微生物在后期發(fā)酵過程中的演替，進(jìn)而影響各種微生物的代謝活動(dòng)。

A-樣品1微生物數(shù)量變化；B-樣品2微生物數(shù)量變化；C-樣品3微生物數(shù)量變化；D-樣品4微生物數(shù)量變化圖2 堆積發(fā)酵和入窖發(fā)酵微生物數(shù)量變化Fig.2 Microbial quantity change of accumulation and cellar fermentation

2.3 堆積發(fā)酵和入窖發(fā)酵過程中酒醅理化指標(biāo)變化分析

如圖3所示，在堆積發(fā)酵前期，由于酒醅中微生物處于穩(wěn)定期，其生長(zhǎng)繁殖，代謝活動(dòng)較和緩，因此淀粉消耗緩慢，酒醅中還原糖變化處于緩升或平緩趨勢(shì)，另外酒精度變化也不明顯。在堆積發(fā)酵后期，由于酒醅中微生物急劇生長(zhǎng)繁殖，代謝產(chǎn)熱，使得淀粉、還原糖迅速下降。另外酒醅中酵母菌大量增殖，酒精度也明顯升高。由于整個(gè)堆積發(fā)酵過程為好氧發(fā)酵，使得酒醅酸度處于緩慢下降趨勢(shì)。因此堆積發(fā)酵過程主要為微生物的富集以及相關(guān)代謝產(chǎn)物的積累，酒精發(fā)酵較微弱。

A-酒醅淀粉含量變化；B-酒醅還原糖含量變化；C-酒醅酸度變化；D-酒醅酒精度含量變化圖3 堆積發(fā)酵和入窖發(fā)酵過程中理化指標(biāo)變化Fig.3 Physical and chemical indexes change of accumulation and cellar fermentation process

如圖3-D所示，樣品1、3在入窖發(fā)酵前10 d，主要為酵母菌利用還原糖進(jìn)行酒精發(fā)酵，產(chǎn)大量的酒精，這與曹維超等人研究結(jié)果類似[19]。同時(shí)氧氣的消耗、酒醅溫度和酒精濃度的升高也抑制酵母菌的生長(zhǎng)，代謝[20]，因此發(fā)酵至第10天時(shí)酵母菌數(shù)量下降至5 lgCFU/g，同時(shí)酒精體積分?jǐn)?shù)達(dá)到3.2%～3.5%。在此期間由于酒精發(fā)酵的劇烈進(jìn)行，酒醅中淀粉下降迅速，還原糖也迅速被消耗，之后還原糖雖然平緩回升，但仍然處于較低濃度。此外細(xì)菌，芽孢桿菌，乳酸菌在此期間生長(zhǎng)繁殖，代謝產(chǎn)酸均被抑制，因此在數(shù)量上變化平緩，且酒醅酸度也平緩上升。在發(fā)酵后期，由于酒精發(fā)酵幾乎停止，微生物代謝活動(dòng)較弱，因此還原糖回升較快，淀粉也平緩下降，直到發(fā)酵結(jié)束。此外樣品3在發(fā)酵22 d之后，酸度上升明顯，還原糖也有所下降，可能是由于樣品3中總細(xì)菌、乳酸菌數(shù)量有所增加(圖2-C)，代謝產(chǎn)酸造成的。由此可見在堆積發(fā)酵過程中控制適宜的微生物菌群數(shù)量可以保證入窖后酒精發(fā)酵的正常進(jìn)行。

如圖3所示，與樣品1、3相比，樣品2、4在入窖后除淀粉消耗相似之外，還原糖、酸度、酒精度變化均存在明顯差異。雖然樣品2、4起始微生物數(shù)量有明顯優(yōu)勢(shì)，但在入窖發(fā)酵前期，酵母菌數(shù)量下降迅速，酒精發(fā)酵被嚴(yán)重抑制，酒精度遠(yuǎn)低于樣品1、3(圖3-D)。尤其是樣品2在整個(gè)發(fā)酵過程中酒精發(fā)酵異常微弱，同時(shí)也正因?yàn)榫凭l(fā)酵被抑制，其還原糖回升也快。因此樣品2、4在發(fā)酵結(jié)束時(shí)出酒率遠(yuǎn)低于樣品1、3，尤其是樣品2的出酒率僅達(dá)8.23%(表2)。

表2 不同樣品流酒量和淀粉出酒率差異比較Table 2 Comparison of liquor quantity and starch liquoryield among different samples

注：樣品5為酒廠實(shí)際發(fā)酵酒醅并于實(shí)驗(yàn)室蒸餾。

推測(cè)可能是由于兩樣品中總細(xì)菌、芽孢桿菌和乳酸菌起始數(shù)量過高，代謝產(chǎn)酸，酒醅升酸快(圖3-C)，酵母菌酒精發(fā)酵被抑制，導(dǎo)致發(fā)酵異常。因此入窖起始微生物菌群數(shù)量過高，入窖后各種微生物之間相互競(jìng)爭(zhēng)，抑制作用激烈，并不利于微生物正常演替以及酒精發(fā)酵，甚至導(dǎo)致發(fā)酵異常。

2.4 堆積發(fā)酵和入窖發(fā)酵過程中乳酸和乙酸變化分析

如圖4所示，在堆積發(fā)酵過程中，酒醅中乳酸呈下降趨勢(shì)。而在堆積發(fā)酵后期，酒醅中酵母菌大量生長(zhǎng)繁殖，代謝產(chǎn)乙醇，加上高溫、氧氣充足的堆積環(huán)境，乙醇被氧化成乙酸[21]，使得各樣品中乙酸量緩慢上升。此外樣品1、3和樣品2、4由于取樣位置不同，導(dǎo)致乙酸和乳酸量也存在差異。

A-酒醅乳酸含量變化；B-酒醅乙酸含量變化圖4 堆積發(fā)酵和入窖發(fā)酵過程中乳酸和乙酸變化Fig.4 Lactic acid and acetic acid change of accumulation and cellar fermentation process

在入窖發(fā)酵前10 d，樣品1、3中乳酸和乙酸量變化平緩，且均處于較低濃度。在此期間，樣品1、3酒精發(fā)酵也正常進(jìn)行，酒精體積分?jǐn)?shù)迅速上升達(dá)到3.2%～3.5%(圖3-D)。此外，樣品3在發(fā)酵22 d以后可能是由于總細(xì)菌、乳酸菌數(shù)量增加，代謝產(chǎn)酸，使得乳酸和乙酸呈上升趨勢(shì)。樣品2、4在入窖發(fā)酵前兩天乳酸量迅速上升，之后發(fā)酵至第10天乳酸量雖然變化平緩，但濃度仍高于樣品1、3。另外樣品2、4中乙酸量卻在不斷增加，濃度顯著高于樣品1、3，尤其是樣品2在發(fā)酵第10天時(shí)乙酸量達(dá)3.45 mg/g酒醅。但在此期間樣品2、4中的酵母菌數(shù)量迅速下降，酒精發(fā)酵被嚴(yán)重抑制，其中樣品4酒精度上升緩慢且遠(yuǎn)低于樣品1、3，而樣品2在發(fā)酵2 d以后，酒精發(fā)酵幾乎停止，酒精體積分?jǐn)?shù)最低且基本未發(fā)生變化(圖3-D)。最終導(dǎo)致樣品2出酒率最低，其次是樣品4，遠(yuǎn)低于樣品1、3出酒率(表2)。因此導(dǎo)致樣品2、4發(fā)酵異常的原因可能是起始微生物菌群數(shù)量過高，代謝產(chǎn)乙酸抑制酵母菌酒精發(fā)酵[22-23]。

2.5 不同酒樣感官品評(píng)差異分析

如表3所示，樣品1和樣品3之間的差異主要存在于酒體風(fēng)格。樣品1由于堆積溫度高(頂溫達(dá)50.9 ℃)，且芽孢桿菌數(shù)量豐富，更有利于風(fēng)味物質(zhì)的合成，使得酒樣焦糊香突出，呈現(xiàn)醬香的同時(shí)兼有芝麻香，與酒廠夏季發(fā)酵酒樣接近，屬于芝麻香型白酒中典型的“醬芝”風(fēng)格。而樣品3由于堆積溫度低(頂溫達(dá)45.7 ℃)，堆積發(fā)酵劇烈程度低于樣品1，因此酒樣焦糊香弱，芝麻香突出，與酒廠冬季發(fā)酵酒樣接近，屬于芝麻香型白酒中典型的“清雅芝麻香”風(fēng)格。樣品2、4在發(fā)酵過程中升酸過快，尤其是乙酸量迅速增加，酵母菌酒精發(fā)酵未能正常進(jìn)行，酒樣呈現(xiàn)尖酸、異味，入口酸澀味重，為發(fā)酵異常。因此在不同的堆積溫度條件下，堆積發(fā)酵結(jié)束時(shí)微生物菌群構(gòu)成不同，最終影響原酒的質(zhì)量和酒體風(fēng)格。

表3 不同酒樣感官品評(píng)和酒體風(fēng)格Table 3 Sensory evaluation and liquor style of different liquor samples

注：樣品5為酒廠實(shí)際發(fā)酵酒醅并于實(shí)驗(yàn)室蒸餾。

3 結(jié)論

堆積發(fā)酵作為芝麻香型白酒生產(chǎn)過程中最為關(guān)鍵的工藝環(huán)節(jié)，通過堆積發(fā)酵，酒醅中酵母菌、霉菌、總細(xì)菌、芽孢桿菌、乳酸菌得到大量富集與篩選，在數(shù)量上達(dá)8.16～9.35 lgCFU/g，為入窖發(fā)酵提供微生物基礎(chǔ)。

在不同堆積發(fā)酵溫度條件下，入窖發(fā)酵初始微生物菌群數(shù)量不同，其中霉菌、總細(xì)菌、乳酸菌數(shù)量較接近，而酵母菌和芽孢桿菌數(shù)量差異明顯。入窖后在厭氧以及特定發(fā)酵溫度條件下，伴隨著微生物菌群進(jìn)一步演替并進(jìn)行相關(guān)代謝活動(dòng)，最終出酒率正常，原酒質(zhì)量合格，但酒體風(fēng)格不同。其中高溫堆積條件下出酒率稍微偏低，但利于生香，酒樣呈現(xiàn)醬香的同時(shí)兼有芝麻香，為“醬芝”風(fēng)格。而低溫堆積條件下利于產(chǎn)酒，酒樣芝麻香突出，為“清雅芝麻香”風(fēng)格。在堆積發(fā)酵結(jié)束時(shí)，表層酒醅中各種微生物數(shù)量處于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其中酵母菌、霉菌、總細(xì)菌數(shù)量達(dá)9.04～9.35 lgCFU/g。單獨(dú)取表層酒醅入窖后，酒醅升酸快，尤其是乙酸量迅速增加，酵母菌下降迅速，最終出酒率低，原酒質(zhì)量不合格?？赡苁怯捎谌虢殉跏嘉⑸锞簲?shù)量過高，入窖后微生物之間相互競(jìng)爭(zhēng)、抑制作用激烈，最終細(xì)菌成為整個(gè)發(fā)酵過程的優(yōu)勢(shì)菌群，代謝產(chǎn)乙酸抑制酵母菌酒精發(fā)酵。因此在堆積發(fā)酵過程中控制適宜的微生物種類和數(shù)量對(duì)入窖發(fā)酵過程、原酒質(zhì)量以及酒體風(fēng)格有重要影響。

由于堆積發(fā)酵的開放環(huán)境，如何更加穩(wěn)定，有效地調(diào)控堆積發(fā)酵過程，為入窖發(fā)酵提供更為合適的微生物基礎(chǔ)以及代謝產(chǎn)物基礎(chǔ)，需要更加深入研究微生物之間的相互作用機(jī)理以及其他環(huán)境因素對(duì)堆積發(fā)酵的影響。

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