125I對(duì)涎腺腺樣囊性癌移植瘤中MMP-2和VEGF的表達(dá)影響*

朱 栩 白忠誠(chéng) 湯楚華 付崇建

涎腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma，SACC)在早期即可發(fā)生局部侵襲且遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率較高，是惡性度較高的口腔頜面部腫瘤[1]。臨床治療主要是手術(shù)擴(kuò)大切除，術(shù)后局部放射治療。125I粒子植入機(jī)體組織內(nèi)放射較外放療具有明顯優(yōu)勢(shì)[2]，在涎腺腺樣囊性癌的治療中，已被普遍應(yīng)用并具有顯著的療效[3-4]。癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)鍵在于細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜的分解，金屬基質(zhì)蛋白酶 -2(matrixmetallop roteinases-2，MMP-2)[5-6]幾乎能降解所有的細(xì)胞外基質(zhì)。毛細(xì)血管新生為腫瘤提供營(yíng)養(yǎng)和癌細(xì)胞遠(yuǎn)處移動(dòng)提供血行性通道[7]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial grow th factor，VEGF)是目前已知的血管生成最重要的調(diào)節(jié)因子。本實(shí)驗(yàn)使用免疫組化SP法測(cè)定MMP-2和VEGF在125I放射粒子照射組和對(duì)照組中的表達(dá)水平，為125I粒子用于臨床治療涎腺腺樣囊性癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 石蠟標(biāo)本制備方法為：將ACC-2細(xì)胞株(由濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供)進(jìn)行體外培養(yǎng)、傳代、收集后，注射到8只裸鼠右腋下皮下，3×107/0.1ml，待瘤體長(zhǎng)至10±2mm時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為2組(4只/每組)，照射組4只裸鼠移植瘤中央植入0.7mci的125I粒子1顆(半衰期60.1d，放射活度0.7mCi2.58×107Bq，上海欣科醫(yī)藥有限公司)，對(duì)照組4只裸鼠移植瘤內(nèi)植入同等大小和材質(zhì)的不含125I的金屬鈦管1顆，4周后處死裸鼠，無(wú)菌條件下取出瘤體自中央切開后放入4%多聚甲醛，制做石蠟標(biāo)本。

1.2 試劑與方法 MMP-2、VEGF鼠抗人單克隆抗體(美國(guó)SANTA CRUZ公司)濃度均為1∶200，S-P免疫組化試劑盒(北京中衫公司)。實(shí)驗(yàn)對(duì)照：陰性對(duì)照用PBS代替一抗，已知陽(yáng)性表達(dá)組織(乳腺癌、口腔鱗癌)為MMP-2、VEGF作陽(yáng)性對(duì)照。

將標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)切片，厚度3μm，每20張取4張。免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白過(guò)氧化酶法(SP二步法)按試劑盒說(shuō)明操作。

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn) 使用高、低倍鏡挑選腫瘤細(xì)胞較豐富且壞死少的視野。MMP-2表達(dá)產(chǎn)物主要分布于細(xì)胞漿，胞漿中出現(xiàn)棕色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性；VEGF表達(dá)產(chǎn)物主要分布胞膜，胞膜中見(jiàn)棕色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性。高倍鏡下各選30個(gè)不同的腫瘤細(xì)胞野使用Image j軟件對(duì)每個(gè)野計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)并計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比，再求其標(biāo)準(zhǔn)差。按shimizu[8]評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行半定量積分判斷結(jié)果：無(wú)明顯陽(yáng)性細(xì)胞為(-)，陽(yáng)性細(xì)胞百分率在1%-25%為(+)、26%-50%為(++)、51%-75%為(+++)、76%-100%為(++++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用(平均值士標(biāo)準(zhǔn)差)表示，用t檢驗(yàn)行兩組之間樣本均數(shù)的比較，P＜0.01為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 MMP-2免疫組織化學(xué)染色 MMP-2主要表達(dá)在SACC瘤細(xì)胞的胞漿中，胞漿中出現(xiàn)棕色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性。MMP-2在對(duì)照組(圖1)呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，在照射組(圖2)呈陰性和弱陽(yáng)性表達(dá)。照射組(圖2)中，在距粒子較近側(cè)細(xì)胞內(nèi)MMP-2多數(shù)呈現(xiàn)陰性表達(dá)，隨腫瘤細(xì)胞與粒子距離逐漸變遠(yuǎn)，MMP-2表達(dá)逐漸增強(qiáng)。

在照射組中癌瘤邊緣處MMP-2表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性(圖2箭頭所示)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞浸潤(rùn)骨骼肌及在神經(jīng)周圍浸潤(rùn)的現(xiàn)象，MMP-2在神經(jīng)周圍的癌組織中表達(dá)明顯強(qiáng)于遠(yuǎn)離神經(jīng)處(見(jiàn)圖3，其中箭頭所指為神經(jīng))。對(duì)照組中腫瘤侵襲骨骼肌處MMP-2的表達(dá)明顯強(qiáng)于遠(yuǎn)離骨骼肌處(見(jiàn)圖4)。

圖2 照射組弱陽(yáng)性400×SP

圖3 神經(jīng)周圍強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(對(duì)照組)400×SP

圖4 瘤細(xì)胞侵襲肌肉處強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(對(duì)照組)400×SP

在照射組和對(duì)照組中分別隨機(jī)取30個(gè)視野，用Iamge j軟件計(jì)數(shù)MMP-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)并計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比，按shimizu評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行半定量積分判斷結(jié)果。MMP-2在照射組陽(yáng)性細(xì)胞百分比為：(22.07±3.6)%，t值為：33.66；顯著低于對(duì)照組陽(yáng)性細(xì)胞百分比：(59.53±8.11)%，t值為：40.22，P＜0.01差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 MMP-2在SACC裸鼠移植瘤中的表達(dá)(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n=30視野)

2.2 VEGF免疫組織化學(xué)染色 VEGF在SACC中主要表達(dá)于瘤細(xì)胞的胞膜中，胞膜中呈現(xiàn)棕色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性。VEGF在照射組(見(jiàn)圖5)主要呈陰性或弱陽(yáng)性，表達(dá)明顯弱于對(duì)照組，在照射組中隨與粒子距離增大，VEGF表達(dá)逐漸增強(qiáng)。VEGF在對(duì)照組中(見(jiàn)圖6)主要呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，越靠近癌瘤浸潤(rùn)的前緣VEGF的表達(dá)越強(qiáng)。

對(duì)照組腫瘤組織中的血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)VEGF強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(圖7，箭頭所示)，周圍呈弱陽(yáng)性或陰性。對(duì)照組腫瘤邊緣可見(jiàn)瘤體包繞神經(jīng)(圖8，箭頭所示)且包繞神經(jīng)處VEGF強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，與周圍組織對(duì)比明顯。

圖5 照射組弱陽(yáng)性400×SP

圖6 對(duì)照組強(qiáng)陽(yáng)性400×SP

圖7 血管內(nèi)皮細(xì)胞處陽(yáng)性表達(dá)(對(duì)照組)400×SP

圖8 在腫瘤邊緣瘤細(xì)胞嗜神經(jīng)(對(duì)照組)400×SP

在照射組和對(duì)照組中分別隨機(jī)取30個(gè)視野，用Iamgej軟件計(jì)數(shù)VEGF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)并計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比，按shimizu評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行半定量積分判斷結(jié)果。VEGF在照射組陽(yáng)性細(xì)胞百分比：(24.3±3.02)%，t值為：44.09；顯著低于對(duì)照組陽(yáng)性細(xì)胞百分比：(63.07±5.72)%，t值為：60.42，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義為P＜0.01。

表2 VEGF在SACC裸鼠移植瘤中的表達(dá)(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n=30視野)

3.討論

最近研究[5]認(rèn)為，在癌癥的發(fā)展中癌細(xì)胞與基質(zhì)間相互作用發(fā)揮主要影響，可使癌細(xì)胞完成對(duì)周圍組織的局部浸潤(rùn)、促使瘤體內(nèi)血管新生為癌細(xì)胞生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造通道。MMP-2幾乎能降解所有的細(xì)胞基質(zhì)和促進(jìn)血管生成及生長(zhǎng)[9]。瘤體內(nèi)血管新生提供營(yíng)養(yǎng)是癌細(xì)胞能繼續(xù)生長(zhǎng)的基礎(chǔ)和首要前提，血管新生也可能是癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移最主要的影響因子。VEGF是目前已知與血管生成最重要的因子。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)MMP-2在照射組陽(yáng)性細(xì)胞百分比為：(22.07±3.6)%，t值為：33.66；顯著低于對(duì)照組：(59.53±8.11)%，t值為：40.22，P＜0.01差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說(shuō)明125I放射粒子可以顯著抑制腫瘤中MMP-2的表達(dá)。在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)MMP-2在腫瘤侵蝕骨骼肌處的細(xì)胞中表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，這符合在腫瘤侵襲時(shí)MMP-2通過(guò)溶解細(xì)胞基質(zhì)建立細(xì)胞間通道促使腫瘤局部侵襲。此外在腫瘤邊緣處的MMP-2表達(dá)要明顯高于遠(yuǎn)邊緣處，說(shuō)明涎腺腺樣囊性癌是一種極具侵襲性的腫瘤，這也提示，在臨床病理HE染色較難判定腫瘤邊界的情況下，通過(guò)MMP-2免疫組化可以幫助明確腫瘤的邊界。研究中還發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)組織周圍的MMP-2陽(yáng)性率要顯著高于其他組織。這與黃圣運(yùn)[10]報(bào)道的MMP-2與神經(jīng)侵犯有一定相關(guān)性。MMP-2在腫瘤細(xì)胞中分泌量大，其在神經(jīng)周圍的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，說(shuō)明在神經(jīng)周圍的癌細(xì)胞有較強(qiáng)的活性，這與SACC極強(qiáng)嗜神經(jīng)性相符合。MMP-2在癌細(xì)胞中分泌增高，其在腫瘤組織的表達(dá)顯著高于正常結(jié)構(gòu)，組織中其分泌增多代表癌細(xì)胞數(shù)目多，腫瘤生長(zhǎng)越旺盛，瘤細(xì)胞對(duì)周圍組織的侵襲能力亦更強(qiáng)[11-12]，大量研究表明其活性和表達(dá)的增多與多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后密切相關(guān)，被認(rèn)為是腫瘤侵襲的特異性指標(biāo)。

在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，VEGF在照射組陽(yáng)性細(xì)胞百分比：(24.3±3.02)%，t值為：44.09；顯著低于對(duì)照組：(63.07±5.72)%，t值為：60.42，P＜0.01差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說(shuō)明125I粒子可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞中VEGF的表達(dá)。在腫瘤浸潤(rùn)的前緣VEGF呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，這說(shuō)明腫瘤前緣的癌細(xì)胞生長(zhǎng)較旺盛，具有強(qiáng)侵襲性，符合其誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移，降解細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜，促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)作用的特性，同時(shí)也說(shuō)明腫瘤前緣的細(xì)胞更易生成血管，提供營(yíng)養(yǎng)向周圍浸潤(rùn)，為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供血行性通道，這與吳巍[13]等研究結(jié)果相一致。在瘤體組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞中，VEGF強(qiáng)陽(yáng)性表現(xiàn)，這符合其高特異性血管內(nèi)皮分裂原特性[14]，說(shuō)明VEGF可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增值、血管新生、腫瘤生長(zhǎng)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[15]。此外，在實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)裸鼠移植瘤中有神經(jīng)出現(xiàn)，這可能與VEGF介導(dǎo)血管生長(zhǎng)對(duì)維持神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和功能有關(guān)，也可能與VEGF和血管上的nrp1相互作用、正反饋調(diào)節(jié)，形成血管和神經(jīng)相伴行，為神經(jīng)生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)和氧支持有關(guān)[16]，也可能是因?yàn)镾ACC癌細(xì)胞具有神經(jīng)內(nèi)分泌性，通過(guò)BDNF/Trk B系統(tǒng)促使血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，使得VEGF表達(dá)增強(qiáng)。具體的相關(guān)機(jī)制是未來(lái)要解決的問(wèn)題及下一步實(shí)驗(yàn)的研究方向。

此外，本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)相同組織或相近組織中(如腫瘤侵襲浸潤(rùn)前緣，腫瘤嗜骨骼肌處)VEGF和MMP-2都呈現(xiàn)高表達(dá)，考慮可能是因?yàn)閂EGF是促進(jìn)MMPS分泌最具活性的因子之一，特別是對(duì)于MMP-2的分泌；同時(shí)，MMP-2能水解血管基底膜膠原蛋白，進(jìn)而突破細(xì)胞基底膜，這是惡性腫瘤發(fā)生侵襲的最為關(guān)鍵的步驟。單純從兩種蛋白同時(shí)升高尚不能說(shuō)明兩者的相關(guān)性。如果要證實(shí)兩者的相關(guān)性，可從分子生物學(xué)角度上探究是否有共同信號(hào)通路，在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中增加MMP-2、VEGF雙抗免疫組化實(shí)驗(yàn)等相關(guān)實(shí)驗(yàn)，再下結(jié)論較為合理，這也將是課題組下一步研究方向。

綜上所述，125I粒子可能通過(guò)抑制MMP-2、VEGF在SACC細(xì)胞中的表達(dá)，進(jìn)而抑制涎腺腺樣囊性癌侵襲、轉(zhuǎn)移。這為125I放射粒子治療涎腺腺樣囊性癌的有效性奠定了初步的理論基礎(chǔ)。

[1]Hata K,Yamamoto Y,Kiyomatsu T,et al.Hereditary gastrointestinal cancer[J].Surgery Today,2015:1-8

[2] Zhang J,Zheng L,Liu SM,et al.Brachytherapy for recurrent malignant tumoursof theparotid gland[J].British Journal of Oral&Maxillofacial Surgery,2015,53(1):58-62

[3] 付尚志,張佳節(jié).125I粒子植入在腫瘤治療中的應(yīng)用[J].臨床軍醫(yī)雜志,2014,42(5):517-519

[4] 姚 秀，顧 玲，劉 穎，等.125I放射粒子植入治療頜面部性惡性腫瘤43例療效分析[J].實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志,2016,32(2):220-224

[5] Puente X S,Sánchez L M,Overall C M,et al.Human and mouseproteases:a comparativegenomic approach[J].Nature Reviews Genetics,2003,4(7):544-58

[6]Gong Y,Chippadavenkata U D,Oh W K.Roles of matrix metalloproteinases and their natural inhibitors in prostate cancer progression[J].Cancers,2014,6(3):1298

[7] Sun H,Guo D,Su Y,et al.Hyperplasia of Pericytes Is One of the Main Characteristics of Microvascular Architecture in Malignant Glioma[J].PloSone,2014,9(12):e114246

[8]Shimizu M,Saitoh Y,Itoh H.Immunohistochemical staining of Ha-ras oncogene product in normal,benign,and malignant human pancreatic tissues[J].Human Pathology,1990,21(6):607-612

[9] Pytliak M,Vargová V,Mechírová V.Matrix Metalloproteinasesand Their Rolein Oncogenesis:A Review[J].Onkologie,2012,35(1-2):49-53

[10]黃圣運(yùn)，周曉清，賈珊珊，等.涎腺腺樣囊性癌中RECK、MMP-2的表達(dá)及與臨床預(yù)后的關(guān)系[J].臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志,2015,31(2):91-94

[11]仲肖靜，顏麗麗.子宮內(nèi)膜腺癌中MMP-2、MMP-9表達(dá)的免疫組化研究[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新,2014(9):48-50

[12]陳 翔，吳曙輝，陸寶華，等.MMP-2、MMP-9在老年結(jié)直腸癌中的表達(dá)及與其臨床病理特征的關(guān)系[J].實(shí)用癌癥雜志,2015(12):1779-1781

[13]吳 巍，姚欣欣，劉境華，等.VEGF與ILK在SACC中的表達(dá)及相關(guān)性研究[J].北華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然),2015(1):47-50

[14]孫鳳琳，王曉峰.VEGF及其相關(guān)調(diào)節(jié)因子促涎腺腺樣囊性癌侵襲轉(zhuǎn)移的研究進(jìn)展[J].口腔醫(yī)學(xué)研究,2014(4):371-374

[15]Sun H,Guo D,Su Y,et al.Hyperplasia of Pericytes Is One of the Main Characteristics of Microvascular Architecture in Malignant Glioma[J].PloSone,2014,9(12):e114246

[16]溫 實(shí)，黃麗娟.血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的VEGF信號(hào)通路[J].兵團(tuán)醫(yī)學(xué),2015,44(2):61-65