血漿miRNA-486-5p作為口腔鱗癌復(fù)發(fā)標(biāo)志物的臨床研究

王璇 閆妍 高山 孫正

口腔癌是全球范圍內(nèi)高發(fā)的惡性腫瘤，其發(fā)病率位居惡性腫瘤第六位，口腔癌中90%為鱗狀細(xì)胞癌，預(yù)后差、易復(fù)發(fā)、具有明確的癌前損害[1-3]。目前缺少客觀的、有效的、微創(chuàng)的監(jiān)測(cè)手段。MicroRNA(miRNA)是一類內(nèi)生的、長(zhǎng)度約為20-24個(gè)核苷酸的小RNA，其在細(xì)胞內(nèi)具有多種重要的調(diào)節(jié)作用[4,5]。MiRNA表達(dá)譜有腫瘤特異性及組織特異性，在口腔癌前病損、鱗癌組織及腫瘤細(xì)胞內(nèi)均可檢測(cè)到某些異常表達(dá)的miRNA。在各種體液中，如血漿、血清、尿液和唾液等，無(wú)細(xì)胞miRNA可以作為癌癥的微創(chuàng)診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物[6]。本研究擬采用高通量測(cè)序方法對(duì)口腔鱗癌患者術(shù)前1周內(nèi)及術(shù)后一年血漿miRNA表達(dá)水平進(jìn)行研究，篩選出能夠反應(yīng)腫瘤復(fù)發(fā)狀況的miRNA；并采用qRT-PCR對(duì)篩選出的指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證,以期發(fā)現(xiàn)能夠反應(yīng)腫瘤復(fù)發(fā)的生物標(biāo)記物。

1.材料與方法

1.1 病例選擇 選擇外科病房口腔鱗癌患者28例，其中男19例，女9例，年齡44-90歲，平均64.32歲。門診招募健康對(duì)照者21例，男6例，女15例，年齡37-73歲，平均54.05歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床及病理診斷口腔鱗狀細(xì)胞癌的患者納入實(shí)驗(yàn)組，口腔健康者納入對(duì)照組；(2)年齡18-90歲，無(wú)免疫系統(tǒng)疾病及HIV感染；(3)未經(jīng)激光，放射線或化學(xué)等治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡18歲以下或90歲以上者；(2)妊娠或哺乳期婦女；(3)有嚴(yán)重心、肺、肝、腎等系統(tǒng)性疾病者；(4)其他腫瘤、精神病患者；(5)有免疫系統(tǒng)疾病或HIV感染者；(6)已經(jīng)激光，放射線或化學(xué)等治療。所有受試者知情同意。其中，有8例在術(shù)后一年隨訪時(shí)有腫瘤復(fù)發(fā)，20例術(shù)后一年無(wú)復(fù)發(fā)。

1.2 標(biāo)本采集及處理 所有受試者均空腹用EDTA抗凝采血管采取靜脈血5ml，口腔鱗癌患者術(shù)前(PB)一周內(nèi)及術(shù)后(PA)一年復(fù)查時(shí)采集兩次，健康對(duì)照者(PH)采集一次。4℃離心，3000轉(zhuǎn)/分，離心5min，取上清于EP管中凍存于-80℃。

1.3 目標(biāo)miRNA篩選 取8例鱗癌(術(shù)后1年復(fù)查無(wú)復(fù)發(fā))術(shù)前及術(shù)后血漿樣本和3例健康對(duì)照組血漿樣本5μl用Illumina公司的Illumina TruSeq Small RNA Sample Prep Kit構(gòu)建小RNA文庫(kù)，使用2100 Bioanalyzer High Sensitivity DNA chip(Agilent)對(duì)純化的cDNA文庫(kù)進(jìn)行確證及定量，并使用KAPA Library Quantification Kit(KAPA biosystems)進(jìn)行濃度定量。使用Illumina HiSeq 2000對(duì)cDNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序(由北京基因組研究所完成)。測(cè)序結(jié)果使用FASTX-Toolkit去除低質(zhì)量讀段后使用Bowtie與人miRNA、其他小RNA(piRNA、tRNA、snRNA、snoRNA及Y RNA)、長(zhǎng)鏈RNA(r RNA、lincRNA、R fam及mRNA)及人類口腔微生物組成分進(jìn)行比對(duì)，并對(duì)表達(dá)量高的前100種miRNAs進(jìn)行主成分分析，對(duì)miRNA表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化后篩選出在口腔鱗癌術(shù)前、后及健康對(duì)照組之間存在明顯表達(dá)差異的miRNAs。某miRNA標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)=(該miRNA計(jì)數(shù)/所有miRNAs計(jì)數(shù))×106。

1.4 血漿miR-486-5p的qRT-PCR驗(yàn)證 取剩余20例鱗癌(其中12例術(shù)后一年無(wú)復(fù)發(fā)，8例術(shù)后一年復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)者手術(shù)前取血漿)術(shù)前及術(shù)后復(fù)查時(shí)血漿樣本和18例健康對(duì)照組血漿樣本各200μl進(jìn)行 PCR驗(yàn)證。首先加入 60μl的 TRIzol LS Reagent試劑提取血漿RNA，并加入1.5μl spikein(Qiagen)，使用cDNA Synthesis kit II(Exiqon)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將所得的cDNA樣品加入到含有miRNA-486-5p引物的Pick-&-Mix microRNA PCR Panels(Exiqon)。將準(zhǔn)備好的PCR板置于Realtime PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。所有的指標(biāo)均設(shè)置3次重復(fù)，并按以下程序進(jìn)行：95℃10min；共40個(gè)PCR循環(huán)(95℃10s，60℃60s，熒光檢測(cè)1次)。miRNA-486-5p表達(dá)值根據(jù)內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。某miRNA相對(duì)表達(dá)量=2-⊿CT(⊿CT=CTsample-CTspike-in)。

1.5 GO分析 利用DAVID在線工具[7]對(duì)miR-486-5p靶基因進(jìn)行GO分析，獲知其參與的生物學(xué)過程。

1.6 統(tǒng)計(jì)處理 如方差齊性，術(shù)前與術(shù)后結(jié)果進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，術(shù)前與健康組、術(shù)后與健康組均進(jìn)行成組t檢驗(yàn)，如方差不齊，則采用秩和檢驗(yàn)。根據(jù)觀察期內(nèi)腫瘤有無(wú)復(fù)發(fā)將口腔鱗癌病例分為復(fù)發(fā)組和無(wú)復(fù)發(fā)組，并將兩組分別進(jìn)行組內(nèi)和組間比較。以雙尾α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 高通量測(cè)序結(jié)果 在去除低質(zhì)量讀段及連接體序列后，清晰讀段的產(chǎn)量平均為5.15×106(范圍從2.83×106到8.47×106)(見表1)。所有樣本的長(zhǎng)度分布分析顯示：在我們預(yù)期的20-24nt處出現(xiàn)峰值，該長(zhǎng)度符合miRNAs的大小。除此之外，在27nt及31-33nt處也出現(xiàn)了峰值(如圖1A)。對(duì)所有樣本的注釋分析顯示：40%的清晰讀段被注釋為人類小RNA，35%符合Y RNAs片段，約9%符合mRNA(見圖1B)。在我們的測(cè)序數(shù)據(jù)中Y RNA片段主要來源于可與人類基因組GRCh37/hg19染色體3:156,871,337-156,871,429配對(duì)的Y4的5′末端，這些片段使得長(zhǎng)度分布在27nt及31-33nt處出現(xiàn)了波峰寬度增加(見圖1A)。

表1 血漿樣本測(cè)序數(shù)據(jù)分析注釋

圖1 血漿小RNAs高通量測(cè)序結(jié)果長(zhǎng)度分布及注釋分析

所有樣本的比對(duì)及注釋分析顯示：在本研究的三組樣本(PB、PA、PH)中，比對(duì)出已知的人類miRNAs分別為1156,1066及810種，其中大部分(745種)miRNAs在三組樣本中均有出現(xiàn)，而分別有161,81及11種為每組中特異性出現(xiàn)的，且均為低表達(dá)量(RPM＜50)，提示我們這些小RNA具有有限的生物學(xué)意義。因此，我們選取的目標(biāo)小RNA為在所有標(biāo)本中均有表達(dá)者，按照表達(dá)量由高到低進(jìn)行排序，前10種見表2。MiRNA-486-5p表達(dá)量最高，占所有miRNAs讀段的39.6%(PH組為53.0%，PA組為44.8%，PB組為21.3%)，且存在差異性表達(dá)(表3)。

表2 血漿測(cè)序數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果排序(前10種，按表達(dá)量由高到低排列)

表3 miRNA-486-5p血漿高通量測(cè)序結(jié)果的組間比較

2.2 PCR驗(yàn)證結(jié)果 各組miRNA-486-5p表達(dá)量見表4。在20名OSCC受試者中有16名在術(shù)后較術(shù)前表達(dá)升高，且此種改變有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。同時(shí)，這種表達(dá)水平的升高也體現(xiàn)在健康對(duì)照組與腫瘤術(shù)前組的比較中(P＜0.05)。為進(jìn)一步研究，我們將腫瘤術(shù)后組與健康對(duì)照組進(jìn)行了比較，結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，這意味著外科手術(shù)后miRNA-486-5p表達(dá)水平表達(dá)得到了恢復(fù)。

表4 miRNA-486-5p在各組中的表達(dá)量

按照腫瘤有無(wú)復(fù)發(fā)將患者分為有復(fù)發(fā)及無(wú)復(fù)發(fā)兩組，將腫瘤術(shù)前(PB)與健康對(duì)照(PH)血漿miRNA-486-5p表達(dá)水平進(jìn)行比較，有復(fù)發(fā)組及無(wú)復(fù)發(fā)組均表達(dá)降低，且此種改變均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

將腫瘤術(shù)后(PA)與術(shù)前(PB)血漿 miRNA-486-5p表達(dá)水平進(jìn)行比較，在無(wú)復(fù)發(fā)的12名患者中，有11名出現(xiàn)miRNA-486-5p表達(dá)升高，且此種改變有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。在腫瘤復(fù)發(fā)的8名患者中，僅有3名患者出現(xiàn)表達(dá)升高，且此種改變無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

將腫瘤術(shù)后(PA)與健康對(duì)照(PH)組血漿miRNA-486-5p表達(dá)水平進(jìn)行比較，復(fù)發(fā)組及無(wú)復(fù)發(fā)組均未出現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的改變。

2.3 GO分析結(jié)果 對(duì)miRNA-486-5p進(jìn)行了GO分析，結(jié)果如下：從圖2中可以發(fā)現(xiàn)miRNA-486-5p參與許多生物過程，如程序性細(xì)胞死亡、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等。尤其是miRNA-486-5p參與包括凋亡的正調(diào)節(jié)和程序性細(xì)胞死亡，這與其在口腔鱗癌患者血漿中的表達(dá)下調(diào)相匹配。

圖2 miR-486-5p靶基因功能注釋圖

3.討論

本研究中，我們選擇了8例無(wú)復(fù)發(fā)口腔鱗癌患者作為研究對(duì)象，分別于術(shù)前1周內(nèi)及術(shù)后一年復(fù)查時(shí)收集血漿標(biāo)本，同時(shí)收集健康人的血漿標(biāo)本，進(jìn)行高通量測(cè)序，旨在篩選血漿中miRNA生物標(biāo)志物用于診斷口腔鱗癌及對(duì)鱗癌患者手術(shù)后的預(yù)后判斷。在術(shù)前和術(shù)后配對(duì)的口腔鱗癌患者血漿和健康對(duì)照血漿中，使用高通量測(cè)序方法分析血漿中的循環(huán)小RNA。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，本研究是第一次使用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)口腔鱗癌中配對(duì)的術(shù)前和術(shù)后血漿樣品中的小RNA進(jìn)行測(cè)序分析，并用于檢測(cè)癌癥復(fù)發(fā)相關(guān)的miRNA的報(bào)告，目前未見其他文獻(xiàn)報(bào)道。測(cè)序結(jié)果顯示，口腔鱗癌術(shù)前血漿中miRNA-486-5p的表達(dá)水平較健康對(duì)照者明顯下調(diào)，術(shù)后又回升到正常水平。

為了避免重復(fù)，我們使用不同的病例集進(jìn)行了PCR驗(yàn)證，包括12例鱗癌無(wú)復(fù)發(fā)者、8例有復(fù)發(fā)者和18例健康對(duì)照者，并據(jù)此分層分組，對(duì)血漿中miRNA-486-5p的表達(dá)水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)鱗癌術(shù)前組和術(shù)后復(fù)發(fā)組的血漿miRNA-486-5p表達(dá)是降低的，而鱗癌術(shù)后無(wú)復(fù)發(fā)組血漿miRNA-486-5p的表達(dá)是升高的。這提示對(duì)于有過鱗癌病史的人群，miRNA-486-5p的降低可能標(biāo)志著鱗癌的復(fù)發(fā)。

我們血漿樣品中表達(dá)最豐富的miRNA是miRNA-486-5p，占所有miRNA讀段總數(shù)的39.6%，在以前的研究文獻(xiàn)中也顯示了血漿中miRNA-486-5p較高的豐度[8]，與本研究的結(jié)果一致。它從錨蛋白1(一種在紅細(xì)胞前體，內(nèi)皮細(xì)胞和骨骼肌中表達(dá)的基因)轉(zhuǎn)錄而來，因此我們?cè)谘獫{中檢測(cè)到高表達(dá)的miRNA-486-5p是不足為奇的。通過文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)：我們檢測(cè)到的非常高的miRNA-486-5p表達(dá)也可能是由用于本研究的文庫(kù)制備試劑盒(Illumina TruSeq小RNA文庫(kù)制備試劑盒)引起的。該試劑盒已報(bào)道產(chǎn)生高于預(yù)期的miRNA-486-5p的表達(dá)[9]。然而，qRT-PCR驗(yàn)證高通量測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA-486-5p可作為口腔鱗癌的潛在診斷生物標(biāo)志物，因?yàn)槠湓诳谇击[癌術(shù)前血漿(PB)和健康對(duì)照血漿(PH)比較中，在PB組中表達(dá)明顯下降。此外，miRNA-486-5p與OSCC復(fù)發(fā)高度相關(guān)，在觀察期內(nèi)，術(shù)前組(PB)與術(shù)后血漿(PA)相比，口腔鱗癌復(fù)發(fā)的患者miRNA-486-5p的表達(dá)失調(diào)現(xiàn)象不顯著。然而，在沒有OSCC復(fù)發(fā)的患者組中，術(shù)前miRNA-486-5p的表達(dá)是顯著下調(diào)的。因此，患者手術(shù)前后miRNA-486-5p的表達(dá)改變可作為生物標(biāo)志物來監(jiān)測(cè)手術(shù)后口腔鱗癌的復(fù)發(fā)。文獻(xiàn)顯示，也已經(jīng)在其他類型的腫瘤中檢測(cè)到miRNA-486-5p的下調(diào)。有研究發(fā)現(xiàn)miRNA-486-5p在乳腺癌組織和細(xì)胞系中被抑制，并通過直接靶向癌基因PIM-1作為腫瘤抑制性miRNA[10]。在肺癌中，miRNA-486-5p通過下調(diào)調(diào)節(jié)腫瘤性ARHGAP5和胰島素生長(zhǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)被鑒定為腫瘤抑制因子，其下調(diào)在血漿樣品中也得到驗(yàn)證[11-13]。在胃癌中，在組織和細(xì)胞系中證實(shí)了miRNA-486-5p的調(diào)節(jié)，并且確定了OLFM4作為其靶標(biāo)[14]。已經(jīng)報(bào)道[15]認(rèn)為，miRNA在腫瘤中的特異性表達(dá)使其可以成為腫瘤的標(biāo)志物，并用于對(duì)腫瘤的診斷和評(píng)價(jià)預(yù)后。miRNA-486-5p在口腔鱗癌組織中表達(dá)下調(diào)[16]，但未見關(guān)于循環(huán)miRNA-486-5p在口腔癌中表達(dá)失調(diào)的報(bào)道。我們的研究也是第一次使用miRNA-486-5p作為口腔鱗癌復(fù)發(fā)的潛在循環(huán)生物標(biāo)志物的報(bào)告。

綜上所述，miRNA-486-5p有潛力作為口腔鱗癌診斷的候選生物標(biāo)志物，可用于手術(shù)后監(jiān)測(cè)口腔鱗癌復(fù)發(fā)的標(biāo)記物。但在這項(xiàng)研究中，一方面，用于測(cè)序和qRT-PCR驗(yàn)證的血漿樣品的數(shù)量是有限的；另一方面，少數(shù)病例血漿miRNA-486-5p的失調(diào)趨勢(shì)不明確，因此，在這里發(fā)現(xiàn)的潛在miRNA生物標(biāo)志物應(yīng)該在大規(guī)模篩選中進(jìn)一步驗(yàn)證以證實(shí)這些發(fā)現(xiàn)。

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