沉默β-catenin表達(dá)對胃癌MGC-803細(xì)胞生物學(xué)行為的影響與作用機(jī)制研究

潘安萍 朱建偉 王忻妍

β-鏈蛋白（β-catenin）是一種多功能的蛋白質(zhì)。在正常細(xì)胞內(nèi)，β-catenin多數(shù)位于細(xì)胞膜，與E鈣黏蛋白及α-catenin一起在細(xì)胞間的黏附中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1]。β-catenin若脫離細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，易被降解，但當(dāng)β-catenin在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生降解異常時(shí)，β-catenin會在細(xì)胞內(nèi)堆積，進(jìn)入細(xì)胞核促進(jìn)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，即β-catenin的另一重要功能-參與Wnt信號通路[2]。β-catenin下游靶基因編碼許多調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)行為的相關(guān)蛋白，如 c-Myc、cyclin D1、Bcl-2、Bax、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-7等，即β-catenin作為轉(zhuǎn)錄因子有可能影響細(xì)胞增殖、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)行為，且有研究發(fā)現(xiàn)β-catenin在多種腫瘤細(xì)胞中明顯高表達(dá)[3]?；诖?，本研究應(yīng)用干擾慢病毒感染β-catenin相對高表達(dá)的胃癌細(xì)胞株MGC-803，沉默其細(xì)胞內(nèi)β-catenin表達(dá)，而后通過多種實(shí)驗(yàn)方法觀察β-catenin表達(dá)下調(diào)對MGC-803細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的影響，同時(shí)檢測沉默β-catenin表達(dá)后的MGC-803細(xì)胞中Bcl-2、Bax、cyclin D1和MMP-7等蛋白表達(dá)水平的變化，初步探討β-catenin下調(diào)影響胃癌MGC-803細(xì)胞生物學(xué)行為可能的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑 MGC-803細(xì)胞株購自上海博谷生物科技有限公司。β-catenin-RNAi慢病毒液、βcatenin-Neg慢病毒液購于上海吉瑪公司；凋亡檢測AnnexinV-PE/7-AAD試劑盒、細(xì)胞周期碘化丙啶（PI）染色試劑盒購于南京凱基生物有限公司；Matrigel膠購于美國BD公司；兔抗人β-catenin單克隆抗體購于美國Santan Cruz公司；鼠抗人β-actin、羊抗鼠IgG-HRP、羊抗兔IgG-HRP單克隆抗體均購于中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 分別將購買的β-catenin-RNAi慢病毒及β-catenin-Neg慢病毒感染MGC-803細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)組（感染β-catenin-RNAi慢病毒的MGC-803-RNAi細(xì)胞）、陰性對照組（感染空載慢病毒的MGC-803-Neg細(xì)胞）、空白對照組（未處理的MGC-803細(xì)胞）。

1.2.2 病毒感染與細(xì)胞培養(yǎng) 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)得知該病毒對MGC-803細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)約為100，將MGC-803細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后實(shí)驗(yàn)組與陰性對照組細(xì)胞分別滴加相應(yīng)慢病毒液，空白對照組加等體積培養(yǎng)基。24h后換液，3d后熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光染色情況。感染效率=帶綠色熒光細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.3 Western blot檢測細(xì)胞 β-catenin、Bcl-2、Bax、cyclin D1及MMP-7表達(dá)水平 用蛋白提取試劑盒提取各組細(xì)胞內(nèi)的總蛋白，分別取20μl進(jìn)行聚丙烯凝膠電泳，結(jié)束后目的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素（NC）膜，5%的脫脂奶粉封閉1h，一抗（1:1 000）4℃封閉過夜，二抗（1:2 500）室溫封閉1h。暗室內(nèi)用發(fā)光液進(jìn)行曝光、顯影、定影，得到目的蛋白條帶的膠片，用Image J軟件檢測各組細(xì)胞 β-catenin、Bcl-2、Bax、cyclin D1 及 MMP-7相對表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.2.4 Annexin-V-PE/7-AAD雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率 將各組細(xì)胞分別接種于6cm培養(yǎng)皿常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞長至約80%～90%融合度時(shí)收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，加入500 μl的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入1 μl Annexin V-PE染液，室溫、避光、反應(yīng)15min，加入5 μl 7-AAD染液，室溫、避光、反應(yīng)15min。過300目尼龍網(wǎng)后1h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.2.5 PI單染流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞周期 取各組細(xì)胞分別接種于6cm培養(yǎng)皿常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞長至約80%～90%融合度時(shí)收取細(xì)胞，每組細(xì)胞取約1×105個(gè)。用PBS清洗2次后用預(yù)冷的75%乙醇溶液1ml重懸細(xì)胞沉淀，4℃固定過夜。第2天1 000r/min離心5min后去固定液，PBS清洗2次，加入100μl的RNase A重懸細(xì)胞沉淀，置于37℃水浴鍋內(nèi)30 min，加入PI染料400μl，4℃避光染色30min。過300目尼龍網(wǎng)后，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.2.6 Transwell法檢測細(xì)胞的侵襲能力 將融好的Mtrigel膠與含10%BSA的1640培養(yǎng)基按體積比1:6混合，后取50μl平鋪于小室的上室面。收集各組細(xì)胞，PBS清洗2次，用完全培養(yǎng)基稀釋成1×105/ml的細(xì)胞懸液。小室的下室面各加入含10%FBS的1640完全培養(yǎng)基500μl，上室面加入200μl各組細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24h后取出小室，擦拭上室面未穿膜的細(xì)胞后結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)分析細(xì)胞侵襲能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察并比較MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞熒光染色情況、β-catenin 表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期、侵襲能力，以及Bcl-2、Bax、cyclin D1、MMP-7 蛋白表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件；計(jì)量資料以表示，3組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞熒光染色情況比較 感染4d后，熒光顯微鏡下可見MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞顯示強(qiáng)綠色熒光，且?guī)ЬG色熒光的細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)比例均超過80%，而MGC-803細(xì)胞無綠色熒光，即MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞慢病毒感染效率＞80%。MGC-803-RNAi細(xì)胞熒光染色情況見圖1（插頁）。

圖1 MGC-803-RNAi細(xì)胞熒光顯微鏡下所見（×100）

2.2 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞β-catenin表達(dá)水平比較 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞β-catenin相對表達(dá)水平分別為0.8725±0.0110、0.8593±0.0074、0.4220±0.0164，3 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），MGC-803-RNAi細(xì)胞β-catenin表達(dá)水平較MGC-803、MGC-803-Neg細(xì)胞下調(diào)（均P＜0.05），而MGC-803-Neg細(xì)胞與MGC-803細(xì)胞間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞 β-catenin蛋白電泳圖比較見圖2。

圖2 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞 β-catenin蛋白電泳圖比較（a：MGC-803 細(xì)胞；b：MGC-803-Neg細(xì)胞；c：MGC-803-RNAi細(xì)胞）

2.3 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞凋亡率比較 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞凋亡率分別為（1.20±0.26）%、（1.35±0.35）%、（8.52±0.82）%，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），MGC-803-RNAi細(xì)胞凋亡率高于 MGC-803、MGC-803-Neg細(xì)胞（均P＜0.05），而 MGC-803-Neg細(xì)胞與MGC-803細(xì)胞間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。流式細(xì)胞術(shù)檢測 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞凋亡率比較見圖3。

圖3 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞凋亡率比較（a：MGC-803 細(xì)胞；b：MGC-803-Neg細(xì)胞；c：MGC-803-RNAi細(xì)胞）

2.4 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞周期比較 以S/G1期細(xì)胞比例為觀察指標(biāo)，MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞分別為 （1.11±0.05）%、（1.09±0.10）%、（0.78±0.08）%，3 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），MGC-803-RNAi細(xì)胞 S/G1期比例低于 MGC-803、MGC-803-Neg細(xì)胞（均P＜0.05），而MGC-803-Neg細(xì)胞與MGC-803細(xì)胞間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。流式細(xì)胞術(shù)檢測MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞周期結(jié)果比較見圖4（插頁）。

圖4 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞周期結(jié)果比較（a：MGC803 細(xì)胞；b：MGC803-Neg細(xì)胞；c：MGC803-RNAi細(xì)胞）

2.5 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞侵襲能力比較 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞穿膜染色數(shù)分別為（109.80±5.36）、（104.40±7.47）、（54.00±6.28）個(gè)，3 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），MGC-803-RNAi細(xì)胞侵襲能力低于 MGC-803、MGC-803-Neg細(xì)胞（均P＜0.05），而 MGC-803-Neg細(xì)胞與MGC-803細(xì)胞間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。Transwell法檢測 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞侵襲能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5（插頁）。

圖5 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi穿膜細(xì)胞顯微鏡下所見比較（a：MGC803 細(xì)胞；b：MGC803-Neg 細(xì)胞；c：MGC803-RNAi細(xì)胞；結(jié)晶紫染色，×200）

2.6 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi 細(xì)胞 Bcl-2、Bax、cyclin D1及MMP-7蛋白表達(dá)水平比較 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞Bcl-2、Bax、cyclin D1及 MMP-7蛋白表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），MGC-803-RNAi細(xì)胞Bcl-2、cyclin D1、MMP-7蛋白表達(dá)水平均低于MGC-803、MGC-803-Neg細(xì)胞（均P＜0.05），Bax蛋白表達(dá)水平高于 MGC-803、MGC-803-Neg細(xì)胞（均P＜0.05），而MGC-803-Neg細(xì)胞與MGC-803細(xì)胞間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＞0.05）。MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞 Bcl-2、Bax、cyclin D1 及 MMP-7 蛋白電泳圖比較見圖6。

3 討論

β-catenin是一種多功能、進(jìn)化保守的蛋白質(zhì)分子，在多細(xì)胞生物的胚胎發(fā)育及機(jī)體穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，一方面β-catenin作為一種轉(zhuǎn)錄活化因子，能介導(dǎo)多種原癌基因與細(xì)胞周期調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄翻譯，促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移，抑制細(xì)胞分化、凋亡，還能誘導(dǎo)腫瘤耐藥，另一方面，腫瘤細(xì)胞中β-catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的異常定位導(dǎo)致細(xì)胞膜上β-catenin含量下降，易使癌細(xì)胞間黏附功能下降，致腫瘤細(xì)胞更易于脫離原發(fā)部位而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[3]。β-catenin參與調(diào)控上述生物學(xué)行為的靶基因編碼蛋白包含 c-Myc、cyclin D1、Bcl-2、Bax、MMP-7、P-gp等[3]。本研究選取β-catenin相對高表達(dá)的胃癌MGC-803細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過干擾慢病毒感染MGC-803細(xì)胞，經(jīng)感染成功的MGC-803細(xì)胞在熒光顯微鏡下有明顯的熒光顯示；并通過Western blot法證實(shí)MGC-803-RNAi細(xì)胞β-catenin表達(dá)水平明顯下調(diào)。本研究再將此穩(wěn)定穿代的3株細(xì)胞（MGC-803-RNAi、MGC-803-Neg及MGC-803細(xì)胞）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，以了解βcatenin表達(dá)下調(diào)對MGC-803細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其可能的作用機(jī)制。

圖6 MGC-803、MGC-803-Neg、MGC-803-RNAi細(xì)胞 Bcl-2、Bax、cyclin D1及 MMP-7蛋白電泳圖比較（a：MGC-803細(xì)胞；b：MGC-803-Neg細(xì)胞；c：MGC-803-RNAi細(xì)胞）

本研究采用Annexin-V-PE/7-AAD雙染流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)β-catenin表達(dá)的下調(diào)可促進(jìn)MGC-803細(xì)胞凋亡。這與在腸癌細(xì)胞中得到的結(jié)果一致[4]。細(xì)胞凋亡過程主要受Bcl-2蛋白家族所調(diào)控，其中最具代表性的為Bax及Bcl-2蛋白，Bax促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡[5]。本研究檢測到沉默β-catenin表達(dá)之后的MGC-803-RNAi細(xì)胞Bcl-2表達(dá)水平明顯下調(diào)，而Bax表達(dá)水平則相對上調(diào)，結(jié)果同預(yù)期。筆者推測，β-catenin表達(dá)異常對MGC-803細(xì)胞凋亡的影響，其機(jī)制與影響Wnt/β-catenin信號通路下游靶蛋白Bax及Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。cyclin是一類在細(xì)胞周期中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的蛋白，其中cyclin D1能調(diào)細(xì)胞周期由G1期順利進(jìn)入到S期[6]。本研究干擾MGC-803細(xì)胞β-catenin的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)MGC-803-RNAi細(xì)胞cyclin D1表達(dá)水平也下調(diào)，且出現(xiàn)明顯的G1期阻滯，細(xì)胞增殖減弱。這與Shtutman等[7]研究結(jié)果相符。筆者推論，沉默β-catenin表達(dá)使MGC-803細(xì)胞阻滯在G1期，其作用機(jī)制與Wnt/β-catenin信號通路下游靶蛋白cyclin D1表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是胃癌患者治療失敗的主要原因。β-catenin作為細(xì)胞黏附中的關(guān)鍵因子，當(dāng)其在細(xì)胞膜中減少時(shí)，細(xì)胞間黏附功能下降，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞易脫離原發(fā)部位。但是游離出來的腫瘤細(xì)胞要在細(xì)胞間質(zhì)中進(jìn)行遷徙，必須能夠分解細(xì)胞外基質(zhì)。在細(xì)胞外基質(zhì)的眾酶中，MMP起著關(guān)鍵的作用[8]。研究顯示，MMP家族蛋白酶的表達(dá)受Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控，其中MMP-7蛋白與腫瘤關(guān)系最密切，MMP-7普遍被發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織及細(xì)胞中明顯高表達(dá)，且MMP-7在相對晚期的胃癌組織中陽性率明顯高于相對早期的胃癌組織[9]。本研究通過Transwell實(shí)驗(yàn)方法發(fā)現(xiàn)，沉默β-catenin表達(dá)之后，MGC-803-RNAi細(xì)胞的侵襲力顯著下降，且MGC-803-RNAi細(xì)胞內(nèi)MMP-7的表達(dá)水平也明顯下降。因此推論β-catenin沉默抑制MGC-803細(xì)胞侵襲能力與Wnt/β-catenin信號通路下游靶蛋白MMP-7表達(dá)水平下調(diào)有關(guān)。這一結(jié)果與在腸癌、食管癌中的研究相似[10]。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，β-catenin表達(dá)下調(diào)可影響胃癌MGC-803細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲等多種生物學(xué)行為，其作用機(jī)制可能與影響Wnt/β-catenin信號通路下游多種靶蛋白表達(dá)有關(guān)。

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