熒光定量PCR檢測在人巨細胞病毒-IgM陰性嬰兒巨細胞病毒感染診斷中的意義

謝利波， 劉敏， 王敏

我國是人巨細胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)感染的高發(fā)區(qū)，HCMV一旦侵入人體，將長期或終身存在于體內，在大多數(shù)免疫正常個體表現(xiàn)為無癥狀感染，但對于胎兒和嬰兒卻可出現(xiàn)明顯癥狀[1]。HCMV感染的靶器官與宿主年齡密切相關，先天性宮內感染的胎兒會導致中樞神經系統(tǒng)損害和各種先天畸形等可能導致死亡的嚴重損害[2-3]。嬰幼兒感染以肝炎、肺炎多見，較大兒童感染則多無癥狀[4]。由于HCMV感染缺少典型的臨床癥狀，但其感染對于嬰兒危害比較大，僅靠臨床表現(xiàn)不能明確診斷，診斷HCMV感染主要依賴于實驗室證據(jù)，包括病毒學檢查或血清學檢查結果的支持[4-5]。大部分醫(yī)院目前沒有開展基于病毒學原理的病毒分離培養(yǎng)方法診斷HCMV感染，而運用經典的酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測HCMV-IgM抗體的檢出率低，特別是對于新生兒和幼小嬰兒由于其產生IgM的能力弱，即使IgM陰性也不能排除HCMV感染的可能[4]。國內外研究顯示，由于病毒DNA的出現(xiàn)通常早于病毒感染的臨床癥狀或血清學反應，熒光定量PCR技術目前已成為了一種能早期、敏感地發(fā)現(xiàn)HCMV感染存在的診斷方法[6-7]。本研究通過分析嬰兒HCMV-IgM抗體陰性情況下聯(lián)合定量檢測嬰兒尿液及其母親乳汁HCMV-DNA的熒光定量結果來探討其在對嬰兒HCMV感染診斷中的意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年1月至2015年12月宜昌市中心人民醫(yī)院兒科收治疑似HCMV感染患兒304例，其中男150例，女154例；年齡2 d至12個月，平均(99.3±44.8)d。根據(jù)患兒主訴及體格檢查、臨床第一診斷將疑似HCMV感染患兒分為肝炎組186例、肺炎組71例及其他組(主訴為發(fā)熱、腹瀉等)47例。肝炎組中男100例，女86例；年齡2 d至4個月，平均(73.0±55.6)d。肺炎組中男31例，女40例；年齡30 d至7個月，平均(113.0±48.7) d。其他組中男19例，女28例；年齡50 d至12個月，平均(98.0±58.9) d。3組患兒在性別、年齡方面比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 納入標準 (1)患兒為母乳喂養(yǎng)；(2)年齡為1歲以內；(3)巨細胞病毒抗體IgM的血清學檢測結果為陰性。

1.3 排除標準 患兒近1個月已使用抗巨細胞病毒藥物如阿昔洛韋、更昔洛韋等。

1.4 方法

1.4.1 標本采集 初診的第2天上午用無菌試管分別留取嬰兒尿液及其母親的母乳及時送檢，不能及時送檢的暫時儲存于4 ℃冰箱中。

1.4.2 檢測方法 所用7300型熒光定量PCR儀(美國ABI)，試劑購自中山大學達安基因股份有限公司。熒光定量PCR檢測HCMV-DNA按試劑說明書操作，乳汁及尿液離心后用生理鹽水洗滌沉淀，12 000 r/min離心5 min后去上清，往沉淀中加DNA提取液50 μL混勻后置于100 ℃金屬浴10 min，12 000 r/min離心5 min后取5 μL做模板進行定量PCR擴增。

1.4.3 結果判斷 HCMV-DNA的標準曲線呈典型的S曲線且標本定量結果>500拷貝/mL為陽性，否則為陰性。所有實驗數(shù)據(jù)在陰、陽對照均在控的情況下獲得。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學處理，計數(shù)資料采用χ2檢驗，多組計數(shù)資料兩兩比較采用bonferroni法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同疾病組HCMV-DNA檢出率比較 見表1。

表1 3組患兒尿液及母乳HCMV-DNA檢出率比較[n(%)]

表1結果表明，肝炎組和其他組尿液HCMV-DNA檢出率顯著低于母乳，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。肺炎組尿液HCMV-DNA檢出率與母乳比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。3組間尿液和母乳中HCMV-DNA檢出率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 不同年齡患兒尿液及母乳HCMV-DNA檢出率比較 見表2。

表2 不同年齡患兒尿液及母乳HCMV-DNA檢出率比較[n(%)]

表2結果表明，年齡<90 d患兒尿液HCMV-DNA檢出率顯著低于年齡90～180 d和>180 d患兒，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；年齡90～180 d和>180 d患兒尿液HCMV-DNA檢出率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；不同年齡患兒乳汁HCMV-DNA檢出率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3 不同標本類型檢出陽性率 見表3。檢出尿液與乳汁同時陽性88例(28.95%)，乳汁陽性174例(57.24%)，尿液陽性141例(46.38%)。

表3 乳汁/尿液HCMV-DNA檢測陰、陽性例數(shù)(n)

3 討論

HCMV感染性很強，致病性卻不是很強，易被宿主抑制而不對機體造成嚴重的持久損害。由于嬰兒免疫功能不完善，阻止HCMV入侵的能力較弱，故極易受感染。嬰兒感染后多數(shù)可能有不同程度的肝膽受損[4]，少數(shù)嬰兒感染后會發(fā)生間質性肺炎。本研究也提示，感染巨細胞病毒患兒中肝炎組例數(shù)最多且其平均年齡最小，同時尿液及母乳雙陽性中有50%出自肝炎組，提示肝臟可能是嬰兒期極易受到巨細胞病毒感染的器官。

我國溫州地區(qū)的一項研究結果顯示，該地區(qū)住院患兒HCMV-IgG陽性率達83%，而1歲以內患兒HCMV-IgG陽性率僅64.1%，且<28 d患兒IgM陽性率僅1%[8]，主要由于嬰兒免疫力低，產生IgM的能力較弱，故假陰性多。目前熒光定量PCR技術已經成為一種獲得公認的快速、高特異性和靈敏度的臨床輔助診斷技術[9-12]。熒光定量PCR技術通過檢測巨細胞病毒DNA載量，使其成為了一種能早期、敏感地發(fā)現(xiàn)巨細胞病毒感染存在的診斷方法[13]，特別在HCMV-IgM陰性的情況下尤其試用。由于巨細胞病毒任何年齡小兒體內HCMV活動復制時，都會在腎臟進行，產生病毒尿癥，卻無明顯的泌尿系統(tǒng)感染表現(xiàn)[5]。處于活動性HCMV感染期的母親乳汁是嬰兒后天感染HCMV的一個重要途徑。由于尿液及乳汁取材方便容易，可重復檢測用于療效監(jiān)測，成為臨床常用的檢測標本。

既往研究多集中在早期、多種方法聯(lián)合檢測巨細胞病毒感染，而此文設定在特定的情況下，即高度懷疑巨細胞病毒感染但無確切巨細胞病毒現(xiàn)癥感染的證據(jù)(HCMV-IgM陰性)時，聯(lián)合尿液及乳汁行巨細胞病毒DNA檢測。此研究發(fā)現(xiàn)，尿液檢出陽性率為46.38%，略高于韓劍英等[14]報道的41.74%，考慮一方面可能與現(xiàn)今市場上熒光定量PCR檢測產品的不斷技術改良有關，另外一方面也可能與病例納入標準不完全一致有關。

翁玉英等[15]對不同標本進行HCMV-DNA檢測，發(fā)現(xiàn)嬰兒尿液及乳汁陽性率均顯著高于淋巴細胞，且母乳陽性率與尿液及淋巴細胞陽性率、HCMV-IgM陽性率均顯著正相關，提出聯(lián)合檢測有助于輔助診斷。沈丹等[16]對3種標本進行HCMV-DNA檢測，提出3次混合尿標本檢出率最高，朱艷萍等[17]和Choudhary等[18]則提出進行尿液HCMV-DNA聯(lián)合血清HCMV-IgM檢測以提高陽性率。由此可見，尿液及乳汁的HCMV-DNA檢測越來越受到廣大兒科醫(yī)生的關注。此研究結果也顯示患兒母乳中HCMV-DNA陽性率均高于50%以上，提示母乳是重要的潛在傳染源，對于先天、后天免疫功能低下或用免疫抑制劑的患兒，有必要預防感染。本研究總共有304例患兒，由于新生兒不足10例，未單獨統(tǒng)計。對于高度懷疑而血清CMV-IgM檢測結果為陰性的，最好能同時檢測HCMV-DNA及抗HCMV抗體，提高檢出率。既往認為HCMV-DNA陽性只能表示感染卻不能區(qū)分產毒感染或潛伏感染[4-5]，但近期隨著研究的深入和完善，有研究表明高HCMV-DNA載量提示活動性HCMV感染[11]，更多研究者提出了聯(lián)合檢測及肯定了尿液HCMV-DNA檢測對于嬰幼兒巨細胞病毒感染的診斷價值[14-18]。但不能證明與臨床感染疾病有直接關系，結合臨床，只能推測。

此研究中304例患兒母乳與尿液HCMV-DNA雙陽性88例，雙陰性77例，雙陰性中有54例來自平均年齡最小的嬰兒肝炎綜合征組，且后續(xù)復查結果證實有尿液HCMV-DNA陽性或CMV-IgM陽性，說明尿HCMV-DNA載量明顯增高可以用作活動性病毒感染的指標。年齡較小的患兒的感染主要來自母親，且由于嬰兒免疫力不完善和HCMV排毒具有間歇性的特點，容易漏檢，對于高度懷疑患兒可考慮需隔段時間復查HCMV-DNA和CMV-IgM或按照沈丹等[16]的方法取3次混合尿標本進行檢測。

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