鈣、鋁金屬元素螯合對燕麥多肽DPP4抑制活性的影響

任露沛，王 鳳，范俊峰

(1北京林業(yè)大學生物科學與技術(shù)學院食品科學與工程系，北京 100083；2中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100000)

二肽基肽酶IV(DPP4)是糖尿病治療的新靶點，可通過調(diào)節(jié)其活性來控制餐后血糖的濃度，腸促胰島素(GLP-1和GIP)是DPP4的天然底物，抑制DPP4活性，可防止腸促胰島素的降解，進而有效降低餐后血糖濃度，因此DPP4被看作是治療2型糖尿病的關(guān)鍵靶標酶之一[1-2]。近年來，人們研究了動植物來源的蛋白多肽(鮭魚、牛奶、雞蛋、燕麥、大米、大豆、小麥和莧菜種子)對DPP4的抑制活性[3-5]。此外，在體外研究中，牛奶全蛋白水解物、酪蛋白水解物、清蛋白水解物以及莧菜種子蛋白水解物均具有DPP4抑制活性，且大多數(shù)研究重點關(guān)注水解物中存在的功能性小肽(含2～8個氨基酸序列的肽)[6-7]。一般認為小肽才具有生物活性，且更易于人體消化吸收，而氨基酸序列超過8個以上的肽在消化過程中可能會被進一步水解[8]。

多肽經(jīng)口腔、胃進入腸道，整個過程經(jīng)歷多種酶解環(huán)境。其中，對多肽具有酶解作用的酶主要是胰蛋白酶和胃蛋白酶，多肽在這些酶的作用下分解成分子量更小的肽以及氨基酸，其中多肽經(jīng)過口腔進入胃部，pH值降為2左右，變化劇烈[9-10]。多肽的利用中，防止多肽的水解是關(guān)鍵，人們采用各種方法如加入糖類、多元醇和明膠等去防止其水解。目前發(fā)現(xiàn)，一些礦質(zhì)元素與肽相互作用，一方面可以改變蛋白和肽的構(gòu)型或生物活性，另一方面可以改善礦質(zhì)元素的吸收性[11-12]。但是這種相互作用能否影響多肽的降解還需要深入研究。LQAFEPLR(LQ8)和EFLLAGNNK(EF9)是筆者從燕麥蛋白中獲得的長鏈DPP4抑制肽。本文利用體外模擬胃腸消化模型，研究兩種多肽(LQ8和EF9)的鈣和鋁的螯合肽在胃腸消化環(huán)境的穩(wěn)定性，并測定體外模擬消化前后肽的紅外光譜和對DPP4的抑制活性。本研究不僅為金屬螯合肽的胃腸消化高耐受性提供理論基礎(chǔ)，還可以為研究金屬螯合肽促進金屬離子轉(zhuǎn)運吸收提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與藥品

多肽EFLLAGNNK(EF9)與DPP4活性位點的結(jié)合能為(-9.1)，LQAFEPLR (LQ8)與DPP4的活性位點的結(jié)合能為(-8.8)，通過上海強耀生物有限公司合成這兩條多肽，EF9的純度 > 96.6%，LQ8的純度 > 99.0%，EF9分子量1 149.25Da，LQ8分子量1 099.23Da。胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰酶粉均購自Sigma 公司；超純水由AquelixTM 5制備；其他檢測試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗設(shè)備

TD5A-WS臺式離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；LL-1 500真空冷凍干燥機，賽默飛世爾科技有限公司；Model 680酶標儀，Bio-RAD；WH-2 型旋渦振蕩器(旋渦混合器)，常州華奧儀器制造有限公司。

1.3 多肽螯合物的制備

把EF9和LQ8按照 5%(w/v)的比例分別溶于超純水中，用檸檬酸和NaOH溶液將溶液pH調(diào)節(jié)到5.4，分別加入無水氯化鈣和無水氯化鋁(多肽∶Ca=2∶1；多肽∶Al = 2∶1)。溶液在55℃下攪拌1.5h，加入3倍體積的無水乙醇去除未螯合的鈣或鋁，得到LQ8-Ca、EF9-Ca、LQ-Al和EF9-Al溶液。將得到的EF9-Ca、LQ8-Ca、EF9-Al和LQ-Al溶液，以8 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min，將析出物分離冷凍干燥，采用EDTA 絡(luò)合滴定法，分別測定Ca和Al的螯合率。

螯合率(%)=V1/V2×100

(1)

式(1)中：V1為滴定螯合態(tài)鈣離子或鋁離子所消耗的EDTA溶液體積(mL)；V2為滴定鈣離子或鋁離子總量所消耗的EDTA溶液體積(mL)。

1.4 體外模擬胃腸道消化

體外模擬胃腸道消化水解參照王鳳[13]的方法進行。分別取5 mg樣品(LQ8、EF9、LQ8-Ca、EF9-Ca、LQ8-Al和EF9-Al)溶解于10 mL 0.03 mol/L NaCl(pH值2.0)，混合液在80℃水浴5 min后冷卻至室溫。以酶和多肽溶液的比例為1∶20(W/W)加入豬胃蛋白酶，在37℃恒溫水浴振蕩器水解，保持穩(wěn)定的pH為2.0，水解時間3 h。調(diào)節(jié)pH到7.5，以酶和多肽溶液比1∶20的比例加入胰蛋白酶和胰酶粉的混合物(1∶1 w/w 胰蛋白酶∶胰酶，提前溶解于0.1 N NaHCO3)，保持恒定pH值7.5和恒溫37℃水解持續(xù)3 h，在75℃水浴20 min終止反應。將水解液離心(10 000×g，30 min)后取上清液凍干，干燥粉末在-20℃保存。水解后得到的樣品分別記為LQ8-H、EF9-H、LQ8-HCa、EF9-HCa、LQ8-HAl和EF9-HAl。

1.5 DPP4抑制活性測定

DPP4活性檢測根據(jù)王鳳[13]的方法進行。反應在96孔板內(nèi)進行，加入10μL DPP4(終濃度為100 ng/mL)，50μL發(fā)光底物Gly-Pro-pNA(終濃度為500μmol/L)，40μL待檢測的多肽樣品，所用的溶解液均為100 mmol/L Tris-buffer緩沖液(pH 8.0)，反應在37℃下培養(yǎng)1.0h，酶標儀405 nm處測其吸光值。每個實驗至少做3組平行。100% 酶活組將以上加樣品步驟換成加Tris-buffer緩沖液，加入量與樣品量一致；自身對照將以上加酶步驟換成Tris-buffer緩沖液，加入量與酶量一致。實驗結(jié)果用DPP4抑制性(%)和IC50值(DPP4抑制活性達到50%時的樣品濃度，mg/mL)表示。

DPP4抑制性(%)=(樣品吸光值-自身對照吸光值)/(100% 酶活吸光值)× 100

(2)

1.6 紅外光譜檢測

采用傅里葉變換紅外光譜儀進行掃描，儀器預熱穩(wěn)定后，采用KBr可拆卸液體池加樣，掃描紅外吸收光譜，掃描范圍400～4 000cm-1，分辨率4cm-1，掃描次數(shù)70，保存譜圖。采用點平滑、歸一化及基線校正等預處理方法對光譜進行處理。將所得特征峰的面積比值作為坐標，用Origin 8.0作圖。

1.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)顯著性由SPSS處理，圖像繪制由GraphPad Prism 5.01和Origin 8.0完成。數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差。

2 結(jié)果與分析

2.1 多肽與金屬元素的螯合率

如圖1所示，多肽LQ8-Ca、EF9-Ca、LQ8-Al和EF9-Al的螯合率分別為12.7%、9.0%、9.3%和12.3%，相比于天然多肽，LQ8和EF9與金屬元素的螯合率比較低。張美玲等[12]研究了大豆分離蛋白與鈣的螯合，終產(chǎn)物的螯合率達到了76.6%，遠高于筆者研究的多肽與鈣的螯合率；崔瀟等[14]研究了羅非魚魚皮膠原多肽與鎂離子的螯合，螯合率達到84.6%；劉永等[15]對羅非魚魚鱗膠原蛋白肽鋅螯合物進行了研究，螯合率為91.96%。LQ9和EF8都是短肽，羧基和氨基這些基團含量少，可以螯合金屬的位點比較少，因此螯合率低。

圖1 LQ8和EF9與鈣和鋁的螯合率

2.2 LQ8和EF9及其金屬螯合物的DPP4抑制活性

如圖2所示，LQ8有很強的DPP4抑制活性，且抑制活性具有濃度依賴性，其IC50值為103.5μM，而研究發(fā)現(xiàn)，EF9的DPP4的抑制活性比較弱，在樣品濃度達到400μg/mL時，其抑制活性僅為31%。LQ8與鈣螯合后，LQ8-Ca對DPP4的抑制活性與LQ8相比變化不大，IC50值為91.6μM；LQ8與鋁螯合后，LQ8-Al對DPP4的抑制活性顯著下降(P<0.05)，在樣品濃度達到400 μg/mL時，其抑制活性僅為57%。EF9-Ca對DPP4的抑制活性相對于EF9顯著升高(P<0.05)，但對DPP4的抑制活性仍然較低，在樣品濃度達到400μg/mL時，其抑制活性僅為45%；EF9-Al對DPP4的抑制活性顯著升高，其IC50值為156μM。這些結(jié)果說明，多肽與金屬元素螯合后，其結(jié)構(gòu)發(fā)生了比較大的變化，導致其活性發(fā)生改變。

圖2 多肽及多肽金屬螯合物體外模擬水解前后的DPP4抑制活性 注：DPP4的終濃度為100 ng/mL；底物的濃度為500μmol/L；多肽的終濃度為5.0、25、50、100、200和400μg/mL

2.3 LQ8和EF9及其金屬螯合物的紅外光譜

當金屬離子與多肽氨基酸殘基結(jié)合后，其變化可以通過肽的羧酸酯和酰胺的特征紅外吸收峰的變化觀察出來[16-17]。圖3A和3B表示多肽及多肽鈣和多肽鋁紅外光譜圖。在3 285～3 347 cm-1處屬于酰胺A帶的N-H 收縮振動峰，1 600～1 647cm-1之間出現(xiàn)的強吸收峰屬于酰胺I帶，是由蛋白多肽骨架C=O伸縮振動所引起的，1 426～1 453 cm-1屬于多肽氨基酸殘基的側(cè)鏈基團，由苯環(huán)骨架振動造成的，1 027～1 088 cm-1處為C-O-C收縮振動峰。LQ8和EF9分別在3 366 cm-1、3 321 cm-1處有吸收峰，當LQ8和EF9分別與鈣和鋁螯合后，LQ8-Ca、EF9-Ca、LQ8-Al和EF9-Al出峰位置都出現(xiàn)了遷移，吸收峰分別變?yōu)? 347cm-1、3 300cm-1、3 327 cm-1、3 285 cm-1，原因是因為鈣或鋁與蛋白螯合后，N-H伸縮振動峰參與了氫鍵的形成[18]。在1 639 cm-1和1 620 cm-1處LQ8和EF9都出現(xiàn)了較強的吸收峰，兩種多肽分別和鈣螯合后，LQ8-Ca和EF9-Ca的吸收峰分別為1 647cm-1和1631 cm-1，說明鈣與氨基有結(jié)合，并發(fā)生了紅移；兩種多肽分別與鋁螯合后，LQ8-Al和EF9-Al的吸收峰分別為1 621cm-1和1 600 cm-1，說明鋁與氨基有結(jié)合，并向短波位移動，這與Shi[19]報道的結(jié)果一致。

2.4 體外模擬水解前后LQ8和EF9及其金屬螯合物對DPP4的抑制活性

利用體外胃腸道模擬消化模型對LQ8、LQ8-Ca、LQ8-Al、EF9、EF9-Ca和EF9-Al進行水解后，這6種多肽仍具有DPP4抑制活性，且對DPP4的抑制活性呈濃度依賴性。相比于LQ8，LQ8-H對DPP4的抑制活性顯著下降(P<0.05)，在樣品濃度達到400μg/mL時，其抑制活性僅為37%；體外模擬水解對LQ8-HCa和LQ8-HAl的影響不大，LQ8-HCa對DPP4仍具有很高的抑制活性，其IC50值為97.6μM，LQ8-HAl對DPP4的抑制活性雖然不高，但相對于LQ8-Al的變化并不大。EF9-HCa和EF9-HAl對DPP4的抑制活性相對于水解前變化也不大，EF9-HCa和EF9-HAl在在樣品濃度達到400μg/mL時，對DPP4的抑制率分別達到了41%和60%。LQ8和EF9兩種多肽經(jīng)體外模擬胃腸道消化后，對DPP4的抑制活性顯著降低，原因是兩種多肽經(jīng)酶水解后，它們的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導致其活性降低；LQ8和EF9與鈣或鋁的螯合可以改變這兩種多肽的構(gòu)象，抑制其進一步發(fā)生水解，保持多肽的活性[10]。

2.5 體外模擬水解前后LQ8和EF9及其金屬螯合物的紅外光譜圖

多肽及多肽的金屬螯合物經(jīng)體外模擬水解后，仍具有典型的蛋白吸收峰(圖3)。LQ8經(jīng)酶水解后，LQ8-H的C=O伸縮振動峰由1 639cm-1移至1 637cm-1，向短波位移動，且吸收峰加強，且LQ8-H在1 051cm-1處的C-O-C吸收峰消失；LQ8-HCa和LQ8-HAl的C=O伸縮振動峰只發(fā)生了遷移，分別從1 647cm-1移動至1 641cm-1和1 621cm-1移動至1 619 cm-1。多肽EF9經(jīng)過體外模擬水解后，EF9-H的C=O伸縮振動峰也發(fā)生了較大的變化，C=O伸縮振動峰由1 620 cm-1移至1 616cm-1，向短波位移動，與LQ8-H的不同的是，EF9-H的吸收峰變?nèi)酰籈F9-HCa和EF9-HAl的吸收峰與EF9-Ca和EF9-Al相比變化不大。

3 結(jié)論

多肽LQ8和EF9對DPP4都有抑制活性，但EF9的抑制活性不高，EF9螯合鈣或鋁之后，EF9-Ca和EF9-Al對DPP4的抑制活性顯著升高；LQ8和EF9被酶水解后，對DPP4的抑制活性顯著下降；LQ8和EF9與金屬元素螯合后，其水解產(chǎn)物LQ8-HCa、LQ8-HAl、EF9-HCa和LQ8-HAl對DPP4的抑制活性基本保持不變；通過傅里葉紅外光譜發(fā)現(xiàn)，多肽金屬螯合物經(jīng)體外模擬水解后，其水解前后紅外光譜基本保持不變，而LQ8和EF9水解前后的紅外光譜變化較大。本研究表明，多肽LQ8和EF9螯合金屬元素后，其構(gòu)象發(fā)生改變，導致其對蛋白酶的耐受性和生物活性發(fā)生變化?！?/p>

圖3 多肽及多肽金屬螯合物體外模擬水解前后的紅外光譜圖

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