效應(yīng)面法優(yōu)化地榆皂苷提取工藝

王玉，劉懷偉，張帥杰

地榆在我國(guó)廣泛分布，主產(chǎn)于東北、西北及華北地區(qū)，性微寒、味苦，歸肝、大腸經(jīng)，功能涼血補(bǔ)血、解毒斂瘡[1]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)其主要含有皂苷類、鞣質(zhì)類等化學(xué)成分[2-3]，據(jù)藥理研究發(fā)現(xiàn)地榆皂苷類成分具有促造血細(xì)胞增殖、抗腫瘤、護(hù)膚養(yǎng)顏等作用，且地榆皂苷促造血細(xì)胞增殖作用較強(qiáng)，單獨(dú)作用能促使2種巨核祖細(xì)胞增殖和分化[4-8]。經(jīng)文獻(xiàn)查閱，地榆皂苷提取工藝的研究較少，主要研究其成分和藥理作用，本實(shí)驗(yàn)采用效應(yīng)面法優(yōu)化地榆皂苷提取工藝。效應(yīng)面法是一種優(yōu)化工藝條件的有效方法，已廣泛用于優(yōu)化中藥有效成分提取工藝，主要通過(guò)非線性模型多元二次回歸方程來(lái)擬合因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，結(jié)果準(zhǔn)確度高、可預(yù)測(cè)性強(qiáng)[9-11]。本研究首次采用效應(yīng)面法優(yōu)化乙醇直接提取地榆皂苷，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)地榆制劑奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

Agilent1260型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；Alltech2000型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（Agilent公司）；BT125D型分析天平（Sartorius公司）；地榆皂苷-Ⅰ對(duì)照品（批號(hào)111952-201301，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；地榆皂苷-Ⅱ?qū)φ掌罚兌龋?8%，批號(hào):D-023-161108，購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司）；地榆藥材（四川科倫藥業(yè)股份有限公司），按《中國(guó)藥典》2015年版一部地榆項(xiàng)下規(guī)定檢測(cè)，均符合要求。甲醇、乙腈為色譜純，所用水為純凈水，本文中所涉及的其他試劑均為分析純（成都市科龍化工試劑廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 地榆皂苷-Ⅰ含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液配制 取地榆皂苷-Ⅰ對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含3 mg的溶液，即得（濃度3.011 mg·mL-1）。

2.1.2 供試品溶液制備 精密移取各實(shí)驗(yàn)項(xiàng)下的提取液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.1.3 色譜條件及專屬性考察 安捷倫C18色譜柱（4.6×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水（30:70）；檢測(cè)波長(zhǎng)為208 nm；柱溫為30 ℃；流速為1 mL·min-1；進(jìn)樣量10 μL；分別取對(duì)照品溶液、空白溶劑、供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，HPLC圖如下圖1。峰型良好，陰性無(wú)干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 地榆皂苷-Ⅰ色譜圖（對(duì)照品溶液、空白溶劑、供試品溶液）

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 分別精密移取不同濃度對(duì)照品溶液（0.3011，0.6022，0.9033，1.2044，1.5055，3.0110 mg·mL-1），按2.1.3項(xiàng)下色譜條件，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度X為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=288.01X+1.1715(r =0.999 4)，表明地榆皂苷-Ⅰ在0.3011～3.0110 mg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取地榆皂苷-Ⅰ對(duì)照品溶液、地榆供試品溶液分別重復(fù)進(jìn)樣6次，按2.1.3色譜條件，測(cè)得地榆皂苷-Ⅰ峰面積的RSD為0.33%，地榆供試品溶液地榆皂苷-Ⅰ峰面積的RSD為0.85%。表明在該色譜條件下儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密移取2.1.2項(xiàng)下供試品溶液6份，按2.1.3色譜條件測(cè)定，RSD=0.93%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密移取2.1.2項(xiàng)下供試品溶液6份，按2.1.3色譜條件分別在0、2、4、12、24、48 h測(cè)定，RSD=0.69%，表明該供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取己知含量的地榆藥材粉末9份，每份約0.1 g，分別精密加入高、中、低含量的地榆皂苷-Ⅰ對(duì)照品溶液，每個(gè)含量平行測(cè)定3份，按2.1.2項(xiàng)下供試品溶液制備，按照2.1.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果地榆皂苷-Ⅰ的平均加樣同收率為99.4%，RSD為1.44%。表明該方法準(zhǔn)確度良好，見(jiàn)表1。

表1 HPLC法測(cè)定地榆皂苷-Ⅰ加樣回收率結(jié)果

2.2 地榆皂苷-Ⅱ含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的配制 取地榆皂苷-Ⅱ?qū)φ掌愤m量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，即得（濃度1.008 mg·mL-1）。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密移取各實(shí)驗(yàn)項(xiàng)下的提取液10 mL，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 HPLC-ELSD色譜條件及專屬性考察 流動(dòng)相為甲醇-水(70:30)，流速：1.0 mL·min-1；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；漂移溫度：100 ℃，氣體流速：3.0 L·min-1。進(jìn)樣量10 μL；分別取對(duì)照品溶液、空白溶劑、供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，HPLC-ELSD圖如下圖2。峰型良好，陰性無(wú)干擾，表明該方法專屬性良好。

圖2 地榆皂苷-Ⅱ色譜圖（對(duì)照品溶液、空白溶劑、供試品溶液）

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 分別精密移取不同濃度對(duì)照品溶液各10 μL（0.1008，0.2016，0.3024，0.4032，0.5040，1.0080 mg·mL-1），按2.2.3項(xiàng)下色譜條件，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，以峰面積積分值的對(duì)數(shù)Y為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度對(duì)數(shù)X為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=1.7463X+2.0059(r=0.999 1)，表明地榆皂苷-Ⅱ在0.1008～1.0080 mg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度考察 取地榆皂苷-Ⅱ?qū)φ掌啡芤骸⒌赜芄┰嚻啡芤悍謩e重復(fù)進(jìn)樣6次，按2.2.3色譜條件，測(cè)得地榆皂苷-Ⅱ峰面積的RSD為1.03%，地榆供試品溶液地榆皂苷-Ⅱ峰面積的RSD為1.87%。表明在該色譜條件下儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性考察 精密移取2.2.2項(xiàng)下供試品溶液6份，按2.2.3色譜條件測(cè)定，RSD=1.91%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密移取2.2.2項(xiàng)下供試品溶液6份，按2.2.3色譜條件分別在0、2、4、12、24、48 h測(cè)定，RSD=1.81%，表明該供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取己知含量的地榆藥材粉末9份，每份約1 g，分別精密加入高、中、低含量的地榆皂苷-Ⅰ對(duì)照品溶液，每個(gè)含量平行測(cè)定3份，按2.2.2項(xiàng)下供試品溶液制備，按2.2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果地榆皂苷-Ⅱ的平均加樣同收率為99.7%，RSD為1.91%。表明該方法準(zhǔn)確度良好，見(jiàn)表2。

表2 HPLC-ELSD法測(cè)定地榆皂苷-Ⅱ加樣回收率結(jié)果

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.3.1響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在查閱文獻(xiàn)[13-15]的基礎(chǔ)上，以乙醇濃度（A）、乙醇用量（B）、提取時(shí)間（C）為考察因素，因素水平表見(jiàn)表3，以地榆皂苷-Ⅰ和地榆皂苷Ⅱ提取量（Y）的綜合評(píng)分為指標(biāo)，Y=地榆皂苷-Ⅰ/Max地榆皂苷-Ⅰ×50+地榆皂苷Ⅱ/Max地榆皂苷-Ⅰ×50，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表4。實(shí)驗(yàn)方法，稱取地榆粉末10 g，按相應(yīng)的條件超聲提取。

表3 因素與水平

表4 黃芪甲苷提取工藝Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

使用統(tǒng)計(jì)軟件Design-Expert8.0.6，對(duì)表4中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程模型：Y=99.94-15.46A+4.90B+2.80C-0.84AB-0.17AC+1.58BC-16.70A2-6.87B2-6.11C2（r=0.9887，P＜0.01）。統(tǒng)計(jì)學(xué)方差分析見(jiàn)表5。

表5 響應(yīng)面模型方差分析

純誤差 0.015 4總和 3884.51 16

由方差分析結(jié)果可知，模型能解釋98.87%的響應(yīng)值變化，回歸方程擬合較好，分析結(jié)果可靠。三個(gè)因素分別對(duì)綜合評(píng)分影響的順序?yàn)锳＞B＞C，模型P＜0.0001，表明該回歸方程擬合情況良好，能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)實(shí)際情況。模擬方程繪制響應(yīng)面等高圖和3D圖，如圖3。

由上圖可知，因素A的曲面較陡峭，且等高線較緊密，說(shuō)明因素A對(duì)響應(yīng)值影響最顯著；當(dāng)因素A一定時(shí)，增加因素B，響應(yīng)值先增加后降低；B和C曲面較平緩，等高線疏松，說(shuō)明因素B和C的交互作用對(duì)響應(yīng)值無(wú)顯著性影響，這與方差分析結(jié)果一致。經(jīng)Design-Expert軟件優(yōu)化得最佳提取工藝為乙醇濃度77.4%，料液比7.6倍，提取時(shí)間28.6 min?？紤]到大生產(chǎn)的實(shí)際可操作性，調(diào)整工藝參數(shù)為乙醇濃度80%，料液比8倍，提取時(shí)間30 min。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按以上優(yōu)化結(jié)果乙醇濃度80%，料液比8倍，提取時(shí)間30 min，進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果地榆皂苷-Ⅰ的含量分別為60.972，61.088，61.094 mg·g-1，平均值為61.051 mg·g-1；地榆皂苷-Ⅱ的含量分別為5.300，5.303，5.295 mg·g-1，平均值為5.299 mg·g-1。與理論預(yù)測(cè)值相比，其相對(duì)誤差小于5%，驗(yàn)證值與回歸方程預(yù)測(cè)值吻合較好，說(shuō)明該模型有良好的預(yù)測(cè)性。

圖3 響應(yīng)面等高圖和3D圖

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用乙醇直接從地榆藥材中提取地榆皂苷成分，經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，工藝參數(shù)為乙醇濃度80%，料液比8倍，提取時(shí)間30 min，與其他文獻(xiàn)報(bào)道，地榆皂苷提取量提高。本實(shí)驗(yàn)采用Box-Behnken設(shè)計(jì)，其充分考慮到各因素的交互作用，設(shè)計(jì)方法簡(jiǎn)單，試驗(yàn)次數(shù)少，在中心點(diǎn)進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)以提高試驗(yàn)精度，同時(shí)采用非線性模型擬合，可信度較好，預(yù)測(cè)值更接近真實(shí)值。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果可知，本工藝穩(wěn)定可行，為工業(yè)化大生產(chǎn)提供了科學(xué)依據(jù)。

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