HPLC法測定舒肝解郁膠囊中蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷的含量

胡潔，茍琰，周娟

舒肝解郁膠囊為成都康弘藥業(yè)集團有限公司獨家品種，其原標準號為YBZ10382008，具有疏肝解郁，健脾安神等功效，用于治療輕、中度單相抑郁癥屬肝郁脾虛證者，癥見情緒低落、興趣下降、遲滯、入睡困難、早醒、多夢、緊張不安、急躁易怒、食少納呆、胸悶、疲乏無力、多汗、疼痛、舌苔白或膩，脈弦或細。處方由貫葉金絲桃和刺五加兩味藥組成。原標準僅有總黃酮的紫外吸收度檢查，專屬性差，可控性不強。貫葉金絲桃含量測定采用的方法多為HPLC，且多為二元梯度，參考了相關(guān)文獻資料[1-2]，進行了二元梯度的分離，分離度和峰形不能達到要求，后改為三元梯度，在進行梯度優(yōu)化后，分離度和峰形均能達到要求。

1 儀器與試藥

Agilent1200高效液相色譜儀（四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器以及Agilent數(shù)據(jù)處理）；甲醇、乙腈（色譜純，F(xiàn)isher公司）；水為Milli-Q超純水；其余試劑均為分析純；對照品。

蘆丁對照品（中檢所：100080-200707，含量9 0.5%），金絲桃苷對照品（中檢所：111521-201004，含量93.9%），異槲皮苷對照品，（中檢所：111809-201202），中國藥品生物制品檢定所；疏肝解郁膠囊，每粒裝0.36g，生產(chǎn)批號：101002,成都康弘藥業(yè)集團有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：AQ Welch（C184.6×250 mm 5 μm）；流動相：A為甲醇，B為乙腈，C為0.1%磷酸溶液，按表1進行梯度洗脫，流速0.6 mL·min-1，柱溫35 ℃，檢測波長為360 nm。色譜圖見圖1。

表1 流動相梯度

圖1 HPLC圖A.缺貫葉金絲桃陰性 B.舒肝解郁膠囊樣品 C.對照品1.蘆丁 2.金絲桃苷 3.異槲皮苷

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取蘆丁對照品20.12 mg；金絲桃苷對照品10.12 mg；異槲皮苷對照品16.40 mg分別置50 ml、25 ml、25 ml的容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取蘆丁對照品溶液5 ml、金絲桃苷對照品2 ml、異槲皮苷對照品1 ml置同一25 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 取疏肝解郁膠囊內(nèi)容物0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇50 ml，稱定重量，超聲處理（250 W，40 kHz）30分鐘，取出，放冷，再稱定重量，用60%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，即得。

2.3 陰性試驗

取缺貫葉金絲桃的試樣，按“2.2.2”項下方法制備，得陰性溶液。結(jié)果在蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷各峰對應(yīng)的保留時間處無干擾雜質(zhì)峰。

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取蘆丁標準品、金絲桃苷對照品、異槲皮苷對照品適量，加甲醇分別制成蘆丁0.4、0.04、0.02、0.005、0.0025 mg·mL-1；金絲桃苷0.4、0.2、0.03、0.008、0.004 mg·mL-1；異槲皮苷0.3、0.15、0.02、0.001、0.0005 mg·mL-1的溶液，分別吸取10 μL，注入液相色譜儀，按色譜條件測定。以對照品進樣量（Y）為橫坐標，峰面積為縱坐標(X)繪制標準曲線。結(jié)果見表2。

表2 線性關(guān)系試驗結(jié)果（N=5）

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度考察 取“2.2.1”項下的混合對照品溶液10 μl，連續(xù)進樣6次，按“2.1”項下色譜條件測定峰面積，結(jié)果蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷的RSD分別為0.72%、0.95%、0.34%。表明儀器性能良好。

2.5.2 重復(fù)性試驗 取同一樣品6份，按照“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液，分別進樣10 μl測定，記錄各成分色譜峰的峰面積，計算含量。結(jié)果蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷含量的平均值（n=6）分別為11.45 mg·g-1、5.64 mg·g-1、8.41 mg·g-1；RSD分別為0.42%、0.36%、0.33%，表明本方法重復(fù)性好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 取同一樣品的供試品溶液，置室溫下放置，分別在0、4、8、16、24、36 h各進樣10 μl，測定各成分色譜峰的峰面積，計算蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷RSD分別為0.69%、0.36%、0.42%，表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 加樣回收率試驗 取已知含量的樣品（批號：101002，含量：蘆丁11.45 mg·g-1；金絲桃苷：5.64 mg·g-1；異槲皮苷：8.41 mg·g-1）6份，每份0.15 g，精密稱定，分別加入蘆丁對照品、金絲桃苷對照品和異槲皮苷對照品適量，按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法制備，并測定含量。結(jié)果蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷的平均回收率(n=6)依次為102.1%（RSD=0.69%），99.9%（RSD=1.23%），102.6%（RSD=1.98%）.結(jié)果見表3。

表3 樣品中蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷加樣回收率試驗結(jié)果(N=2)

2.5.5 耐用性試驗 取樣品（批號：101002），精密稱定，按擬定的含量測定方法，對同一批號樣品，不同分析人員，不同設(shè)備,不同色譜柱進行測定。其含量結(jié)果見表4。

表4 樣品中蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷耐用性試驗結(jié)果(N=2)

2.6 樣品測定

分別精密稱取11批不同批號樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，每批樣品采用雙針雙樣進行測定。結(jié)果見表4。

表4 樣品測定結(jié)果（n=2）

3 討論

按文獻資料的條件對樣品中的蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷進行測定，發(fā)現(xiàn)金絲桃苷和異槲皮苷因為結(jié)構(gòu)相似，分離度較差。于是對流動相進行了優(yōu)化，采取甲醇、乙腈、0.1%磷酸溶液三相流動相，在梯度洗脫條件下，各組分保留時間在30分鐘左右，分離度好。

本實驗首次采用高效液相色譜方法同時測定舒肝解郁膠囊中三種成分的含量，并進行了方法學(xué)考察，所建立的方法簡單易行、干擾小，為舒肝解郁膠囊質(zhì)量標準的全面提高提供了科學(xué)依據(jù)。

[1]楊志芳,王維娜, 楊坤,王先榮, 楊新波,黃正明.HPLC法測定不同產(chǎn)地黃蜀葵花中金絲桃苷異槲皮苷及槲皮素-3'-葡萄糖苷含量[J]中國科學(xué)院上海冶金研究所; 材料物理與化學(xué)(專業(yè)) 博士論文 2000年度

[2]王光涵，張振秋，張穎，姜鴻，鄒桂欣HPLC法測定刺玫果中蘆丁和金絲桃苷的含量[J]遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報 2010年06期