EGFR19/21基因突變與NSCLC組織中 p53蛋白表達(dá)的關(guān)系及對(duì)預(yù)后的影響

陳焱，宋小平

1北京新里程腫瘤醫(yī)院外科，北京100081

2清華大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科，北京100081

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的發(fā)病率維持在443/10萬～567/10萬，在合并吸煙或者其他高危因素的人群中，其發(fā)病率可進(jìn)一步升高[1-2]。NSCLC患者的5年生存率或者中位生存時(shí)間等指標(biāo)均較低[2]，治療后，其無進(jìn)展生存期或者無瘤生存期等指標(biāo)依然不太理想。個(gè)體化治療在NSCLC的治療過程中占據(jù)了重要的地位，在延長NSCLC患者生存時(shí)間、緩解NSCLC患者病情方面發(fā)揮重要的作用?；蛲蛔兡軌蛴绊慛SCLC治療的敏感性，導(dǎo)致個(gè)體化臨床治療結(jié)局出現(xiàn)差異。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的基因突變，能夠影響EGRF下游信號(hào)通路的激活程度，抑制不同腫瘤信號(hào)蛋白的上調(diào)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、分化等病理過程[3-4]。為了進(jìn)一步揭示EGFR19/21基因突變與NSCLC的關(guān)系，本研究收集了98例NSCLC患者的NSCLC組織標(biāo)本，旨在探討EGFR19/21基因突變與NSCLC組織中p53蛋白表達(dá)的關(guān)系及其對(duì)患者預(yù)后的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2010年1月至2013年7月北京新里程腫瘤醫(yī)院和清華大學(xué)第一附屬醫(yī)院的98例NSCLC患者的NSCLC組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①NSCLC患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《中國原發(fā)性肺癌診療規(guī)范（2015年版）》的標(biāo)準(zhǔn)[1]；②采用2010年美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)（American Joint Committee on Cancer，AJCC）最新分期（第7版）中的標(biāo)準(zhǔn)；③患者年齡＜80歲；④所有患者均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為NSCLC；④未合并其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾病者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者于采集標(biāo)本前已經(jīng)實(shí)施過放、化療；②患者合并其他部位的惡性腫瘤；③患者的各項(xiàng)臨床、病理學(xué)資料缺失。98例NSCLC患者中，男67例，女31例；年齡41～79歲，平均（58.0±10.0）歲；腫瘤直徑：＞3 cm者41例，≤3 cm者57例；TNM分期：Ⅰ期25例，Ⅱ期40例，Ⅲ期28例，Ⅳ期5例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者46例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者52例；分化程度：高分化25例，中分化30例，低分化43例；EGFR19/21基因檢測結(jié)果：EGFR19/21突變患者44例，EGFR19/21野生型患者54例。

1.2 檢測方法

免疫組織化學(xué)法檢測p53蛋白的表達(dá)情況：石蠟切片脫蠟至水，采用離子水進(jìn)行反復(fù)洗滌，加入牛奶液體封閉抗體，封閉時(shí)間為5 min，加入p53蛋白抗體（鼠來源，購自Abcam公司），37℃孵育2 h，采用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，滴加熒光染色標(biāo)記的二抗抗體（購自Abcam公司），37℃孵育30 min，加入磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗滌，采用南京凱基生物制劑公司生產(chǎn)的顯色劑進(jìn)行顯色，封片，鏡下觀察。采用Taqman-ARMS法檢測腫瘤組織中EGFR19/21基因的突變情況。

Taqman-ARMS法檢測基因突變：取凍存的血清保存液體，按照10 000 r/min的離心速度進(jìn)行離心分離，離心時(shí)間為5 min，每1 ml的TRⅠZOL試劑裂解的樣品中加入0.2 ml的氯仿，進(jìn)行裂解操作，4℃冰上采用無酶的RNA沖洗液進(jìn)行洗滌，再次10 000 r/min離心5 min，得到RNA?；旌弦涸诩尤肽孓D(zhuǎn)錄酶MMLV之前先70℃干浴3 min，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μl，37 ℃水浴60 min，室溫放置5 min使其完全溶解，使其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以β-actin為模版，在反應(yīng)體系中加入SYBR Green 1染料、上游引物、下游引物、dNTP，使得總體積達(dá) 20 μl，上機(jī)，反應(yīng)條件：93℃ 2 min，93℃ 1 min，55℃ 2 min，共40個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物擴(kuò)增后進(jìn)行基因多態(tài)性檢測：參考MultiplexKit試劑盒（南京凱基生物科技有限公司）使用說明書，加入各位點(diǎn)對(duì)應(yīng)延伸引物進(jìn)行單堿基測序反應(yīng)。采用ABⅠ1310（購自美國Life Technologies公司）完成電泳，結(jié)果用Gene-Mapper軟件（購自美國Life Technologies公司）進(jìn)行分析。

1.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)

觀察NSCLC患者p53蛋白的陽性表達(dá)情況，比較不同臨床特征NSCLC患者EGFR19/21基因突變發(fā)生率的差異，比較EGRF突變組患者與野生型組患者生存情況的差異，分析NSCLC患者預(yù)后的影響因素。免疫組化結(jié)果判定：p53蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核，呈現(xiàn)黃色、棕黃色、褐色顆粒即為陽性表達(dá)。根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分：若細(xì)胞無染色，則計(jì)0分；若細(xì)胞染色為淡黃色，則計(jì)1分；若細(xì)胞染色為棕黃色，則計(jì)2分；若細(xì)胞染色為褐色、黑色，則計(jì)3分。根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例評(píng)分：陽性細(xì)胞數(shù)目占總細(xì)胞的10%及以下，則計(jì)1分；陽性細(xì)胞數(shù)目占總細(xì)胞的11%～50%，則計(jì)2分；陽性細(xì)胞數(shù)目占總細(xì)胞的51%～75%，則計(jì)3分；陽性細(xì)胞數(shù)目占總細(xì)胞的76%及以上，則計(jì)4分。每例患者的總分=染色強(qiáng)度評(píng)分×陽性細(xì)胞所占比例評(píng)分；分值范圍為0～12分；總分＜3分為陰性，≥3分為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件對(duì)-數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存時(shí)間的比較采用Log-rank檢驗(yàn)；多因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFR19/21基因突變與NSCLC患者 p53蛋白表達(dá)的關(guān)系

EGFR19/21基因突變組NSCLC患者p53蛋白的陽性表達(dá)率為38.64%，低于野生型組NSCLC患者的59.26%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.125，P＜0.05）。（表1）

表1 EGFR19/21基因突變NSCLC患者 p53蛋白表達(dá)情況[ n（%）]

2.2 EGFR19/21基因突變與NSCLC患者臨床特征的關(guān)系

不同年齡、性別、腫瘤直徑、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、病理類型、ECOG評(píng)分NSCLC患者EGFR19/21突變的發(fā)生率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

表2 EGFR19/21基因突變與NSCLC患者臨床特征的關(guān)系

2.3 EGFR19/21基因突變與NSCLC患者生存率的關(guān)系

EGFR19/21突變組患者的3年累積生存率為55.80%，高于野生型組的 33.50%（χ2=4.339，P＜0.05）。突變組和野生型組各有2例患者失訪，突變組患者的生存時(shí)間為34.0個(gè)月（95%CⅠ：26.5～38.9），長于野生型組的 27.0個(gè)月（95%CⅠ：20.86～33.14）[Log Rank（Mantel-Cox）=5.9335，P＜0.05]。（圖1）

圖1 兩組患者的生存曲線

2.4 NSCLC患者預(yù)后影響因素的多因素分析

以NSCLC患者的3年累積生存率作為因變量，以NSCLC患者的年齡、性別、腫瘤直徑、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、分化程度、病理類型、ECOG評(píng)分及p53蛋白表達(dá)作為自變量進(jìn)行Cox回歸分析，結(jié)果顯示：TNM分期高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度為低分化、p53蛋白陽性表達(dá)是影響NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），EGFR19/21基因突變是影響NSCLC患者預(yù)后的保護(hù)因素（P＜0.05）。（表3）

3 討論

NSCLC的病情進(jìn)展可以導(dǎo)致患者的生存預(yù)后的惡化，流行病學(xué)研究顯示，NSCLC的臨床總體治療效果仍然較差，臨床總體治療敏感性不足35%[5-6]。揭示NSCLC患者治療敏感性差異的原因，能夠?yàn)楹罄m(xù)臨床上NSCLC的治療、預(yù)后評(píng)估或者隨訪等提供參考依據(jù)?；蛩降母淖兛赡苁怯绊慛SCLC臨床治療結(jié)局的重要因素，基因的改變能夠通過對(duì)效應(yīng)蛋白表達(dá)的影響干預(yù)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特征[6]。EGFR19/21是重要的血管內(nèi)皮生長因子受體家族成員，其對(duì)于配體的結(jié)合作用能夠影響AKT或者Notch信號(hào)通路的激活，促進(jìn)下游腫瘤細(xì)胞對(duì)于鄰近正常組織的浸潤，增加腫瘤細(xì)胞通過淋巴結(jié)或者血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)[7-8]。EGFR19/21基因突變的發(fā)生能夠影響EGFR19/21對(duì)于配體結(jié)合的生物學(xué)效應(yīng)，導(dǎo)致EGFR蛋白的空間結(jié)構(gòu)的改變，影響其蛋白的生理功能[9]。部分研究認(rèn)為，EGFR19/21基因突變導(dǎo)致的蛋白水平的變化，在抑制下游信號(hào)通路蛋白的激活方面均具有一定的作用[10]，p53信號(hào)通路是重要的腫瘤細(xì)胞信號(hào)通路，其表達(dá)水平的改變能夠在細(xì)胞周期的調(diào)控、細(xì)胞生物學(xué)特征的維持或者腫瘤細(xì)胞凋亡、調(diào)控過程中發(fā)揮作用，降低腫瘤細(xì)胞的程序性凋亡水平，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，提高腫瘤細(xì)胞分化障礙的發(fā)生率。

表3 影響NSCLC患者預(yù)后的多因素分析

本研究發(fā)現(xiàn)，EGFR19/21基因突變組患者p53蛋白的陽性表達(dá)率為38.64%，低于野生型組的59.26%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示基因突變組患者體內(nèi)的腫瘤相關(guān)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)濃度較低，p53蛋白的異常表達(dá)能夠在下列幾個(gè)方面影響腫瘤的發(fā)生：①EGFR19/21基因突變組患者體內(nèi)突變的EGFR，能夠?qū)е屡潴w結(jié)合障礙，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的形成，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞血流灌注發(fā)生障礙，腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)信號(hào)通路p53蛋白的合成明顯減少；②突變的EGFR能夠?qū)е禄颊遬53基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子的相對(duì)沉默，導(dǎo)致p53蛋白的翻譯減少[11-12]。王灃等[13]、馬玲等[14]通過探討73例肺癌患者的基因突變水平發(fā)現(xiàn)，EGFR的突變程度對(duì)于體內(nèi)不同信號(hào)通路蛋白，特別是p53或者P16等蛋白的表達(dá)具有重要的影響，EGFR的突變風(fēng)險(xiǎn)越高，抑癌基因蛋白的表達(dá)濃度越低。但本研究并未發(fā)現(xiàn)不同的臨床特征對(duì)于EGFR19/21基因突變的影響，細(xì)胞分化程度、臨床分期或者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等特征的差別，并不會(huì)影響到基因水平的改變，其內(nèi)在并不具有直接的關(guān)聯(lián)，這主要考慮基因水平的改變或者波動(dòng)可能主要與患者腫瘤相關(guān)因子水平或者蛋白翻譯轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中的變化有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，EGRF突變組NSCLC患者的3年累積生存率為55.80%，高于野生型組NSCLC患者的33.50%（χ2=4.339，P＜0.05），提示EGRF突變組NSCLC患者的生存預(yù)后更好，生存率的改變可能與EGRF突變導(dǎo)致的NSCLC患者腫瘤細(xì)胞治療敏感性的改變、治療后腫瘤微環(huán)境的破壞或者腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)活性的破壞等有關(guān)。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析結(jié)果也顯示，TNM分期高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度為低分化、p53蛋白陽性表達(dá)是影響NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），EGFR19/21基因突變是影響NSCLC患者預(yù)后的保護(hù)因素（P＜0.05），進(jìn)一步提示了EGRF突變對(duì)于NSCLC患者臨床預(yù)后的影響。臨床分期或者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等臨床特征與患者生存預(yù)后的關(guān)系，主要考慮與其對(duì)于患者鄰近正常組織的直接性浸潤過程有關(guān)，而關(guān)于EGFR19/21基因突變或者p53蛋白的表達(dá)與患者生存預(yù)后的關(guān)系，則提示臨床上可以通過針對(duì)性沉默相關(guān)指標(biāo)，進(jìn)而改善治療結(jié)局。

綜上所述，本研究的創(chuàng)新性在于探討了EGFR19/21基因突變對(duì)于NSCLC患者生存預(yù)后的影響，揭示了EGFR19/21基因突變與NSCLC患者p53蛋白表達(dá)的內(nèi)在關(guān)系。EGFR19/21基因突變NSCLC患者的p53蛋白呈高表達(dá)，其可能影響到多種生物學(xué)機(jī)制，進(jìn)而參與到NSCLC的發(fā)病過程中。

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