miRNA-145、Ki-67、survivin、Aurora-b在喉鱗狀細胞癌中的表達及臨床意義

楊酉，谷曼麗

1北京怡德醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，北京100097

2北京市優(yōu)聯(lián)耳鼻喉科醫(yī)院鼻咽喉-頭頸外科，北京100122

喉癌是一種常見的耳鼻咽喉科惡性腫瘤，占全身惡性腫瘤的近8%，發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1-2]。喉鱗狀細胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）是喉癌的主要病理類型，具有病死率高、預后差等特點。目前的研究認為，飲酒、吸煙等外界因素及遺傳因素共同作用導致了喉癌的發(fā)生和發(fā)展。喉癌的發(fā)生和發(fā)展是一個多種基因參與、多個階段相互作用的過程，因此基因的研究也逐漸成為喉癌病因?qū)W研究的重點[3-4]。miRNA-145是一種新發(fā)現(xiàn)的高度保守的miRNA，在各種腫瘤組織中低表達，且與腫瘤的預后密切相關[5]。Ki-67是一種與細胞有絲分裂密切相關的核蛋白，在各種腫瘤組織中高表達[6]。survivin是一種目前已知的最強的凋亡抑制蛋白，在正常分化的組織中幾乎不表達，而在腫瘤組織中高表達[7]。Aurora-b是一種與細胞有絲分裂密切相關的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在多種腫瘤組織中高表達[8]。目前，miRNA-145、Ki-67、survivin、Aurora-b與喉癌發(fā)生和發(fā)展關系的研究報道尚不多見。本研究探討miRNA-145、Ki-67、survivin、Aurora-b在LSCC中的表達情況，并分析其與患者臨床特征的關系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年12月至2017年6月于北京市優(yōu)聯(lián)耳鼻喉科醫(yī)院接受全喉和部分喉切除術(shù)并經(jīng)病理證實的85例LSCC患者的組織標本。85例患者中，男62例，女23例；年齡45～72歲，中位年齡55.8歲，≤60歲49例，＞60歲36例；高分化16例，中分化37例，低分化32例；腫瘤直徑：≤2 cm 50例，＞2 cm 35例；TNM分期：Ⅰ期30例，Ⅱ期28例，Ⅲ期19例，Ⅳ期8例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52例。另選取85例癌旁正常組織（距癌組織＞10 mm）標本作為對照。所有患者均有完整的臨床資料，術(shù)前均未接受過任何化療、放療及生物治療。

1.2 主要試劑

Trizol試劑盒、第一鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR（Real-Time PCR，RT-PCR）試劑盒均購自美國Ⅰnvitrogen公司；兔抗人Ki-67、survivin、Aurora-b多克隆抗體均購自美國Abcam公司。

1.3 RT-PCR檢測LSCC組織及癌旁正常組織中miRNA-145的表達

根據(jù)Trizol試劑盒說明書提取組織中總RNA，利用微量紫外分光光度計檢測并確定RNA濃度及純度。根據(jù)第一鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后采用RT-PCR試劑盒將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行擴增，反應體系（20 μl）：cDNA 2 μl，上游引物（10 μmol/L）0.4 μl，下游引物（10 μmol/L）0.4 μl，SYBR Green solution 10 μl，滅菌雙蒸水7.2 μl。反應條件：95 ℃、10 min，95 ℃、5 s，60 ℃、1 min，共40個循環(huán)。miRNA-145上游引物：5'-ATCGTCCAGTTTTCCCAGG-3'，下游引物：5'-CGCCTCCACACACTCACC-3'。內(nèi)參U6上游引物：5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，下 游 引 物 ：5'-CGAACGCTTACGAATTTG-3'。 采 用 2-ΔΔCt法 分 析miRNA-145的表達量，其中△△Ct=（待測組目的基因Ct值－待測組內(nèi)參基因Ct值）－（對照組目的基因Ct值－對照組內(nèi)參基因Ct值）。

1.4 免疫組化法檢測Ki-67、survivin、Aurora-b的表達

石蠟標本包埋，于二甲苯、梯度酒精中脫蠟水化，3%的過氧化氫滅活30 min后，置于枸櫞酸鹽緩沖液中，于微波爐中熱修復10 min。兔抗人Ki-67、survivin、Aurora-b多克隆抗體4℃孵育過夜，加入相應二抗室溫孵育1 h，DAB顯色，蘇木素復染、梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。選取磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.5 結(jié)果判斷

在顯微鏡下觀察，Ki-67、survivin蛋白主要表達于細胞質(zhì)中，若出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒，則為陽性表達；Aurora-b蛋白主要表達于細胞核中，若出現(xiàn)棕褐色顆粒，則為陽性表達。在400倍顯微鏡下隨機觀察1張組織切片中的5個視野，采用雙盲法對染色結(jié)果進行評估。根據(jù)染色程度評分：未著色記為0分，淺黃色記為1分，棕黃色記為2分，棕褐色記為3分。根據(jù)陽性細胞占視野中細胞總數(shù)的百分比進行評分：未發(fā)現(xiàn)陽性細胞記為0分，1%～10%記為1分，11%～50%記為2分，51%～80%記為3分，≥81%記為4分。每張切片的最后得分為兩次評分的乘積：0分為陰性（－），1～4分為弱陽性（+），5～8分為中等陽性（++），9分及以上為強陽性（+++）。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件對-數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用Fisher確切概率法及χ2檢驗；相關性分析采用Pearson相關分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LSCC組織及癌旁正常組織中miRNA-145表達量的比較

LSCC組織中miRNA-145的表達量為（0.72±0.10），明顯低于癌旁正常組織的（2.18±0.44），差異有統(tǒng)計學意義（t=29.831，P＜0.01）。以0.72為界限，將85例LSCC組織進行分組，表達量≥0.72為陽性表達，表達量＜0.72為陰性表達，其中51例陰性表達，34例陽性表達。

2.2 miRNA-145、Ki-67、survivin及Aurora-b陽性表達率的比較

LSCC組織中miRNA-145的陽性表達率明顯低于癌旁正常組織，Ki-67、survivin、Aurora-b的陽性表達率均明顯高于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。（表1）

2.3 miRNA-145、Ki-67、survivin及Aurora-b的陽性表達率與LSCC患者臨床特征的關系

不同性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度LSCC患者的miRNA-145、Ki-67、survivin及Aurora-b陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。Ⅲ～Ⅳ期LSCC患者的miRNA-145陽性表達率明顯低于Ⅰ～Ⅱ期患者，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移LSCC患者的miRNA-145陽性表達率明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。Ⅲ～Ⅳ期LSCC患者的Ki-67、survivin及Aurora-b陽性表達率均明顯高于Ⅰ～Ⅱ期患者，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移LSCC患者的Ki-67、survivin及Aurora-b陽性表達率均明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。（表2）

表1 LSCC組織和癌旁正常組織中miRNA-145、Ki-67、survivin及Aurora-b陽性表達情況比較[ n（%）]

2.4 LSCC組織中miRNA-145、Ki-67、survivin及Aurora-b表達的相關性

經(jīng)Pearson相關性分析，LSCC組織中miRNA-145與Ki-67、survivin、Aurora-b的表達均呈負相關（r=-0.624、-0.862、-0.571，P＜0.01），Ki-67與 survivin的表達呈正相關（r=0.893，P＜0.01），Ki-67與Aurora-b的表達呈正相關（r=0.576，P＜0.01），survivin與Aurora-b的表達呈正相關（r=0.884，P＜0.01）。

3 討論

喉癌的發(fā)生和發(fā)展是一個多種基因參與、多個階段相互作用的過程，包括癌基因的激活、抑癌基因的失活、凋亡蛋白及抑凋亡蛋白的異常表達[3-4]。miRNA是一類長度約為20 nt高度保守的能夠與靶基因結(jié)合的小分子RNA，通過調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄，參與細胞的生命歷程。miRNA-145的基因位于染色體5q32位點，被認為是一種抑癌miRNA，在乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌等多種腫瘤組織中低表達，但在LSCC中的表達水平報道較少[5]。本研究通過RT-PCR檢測85例LSCC組織及85例癌旁正常組織中miRNA-145的表達量，結(jié)果與張定富等[9]的研究報道一致：LSCC組織中miRNA-145的表達量明顯低于癌旁正常組織，提示miRNA-145在LSCC的發(fā)生過程中起抑癌作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，miRNA-145的陽性表達率與LSCC患者的TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關（P＜0.01），而與患者的年齡、性別、腫瘤直徑、分化程度無關（P＞0.05），說明miRNA-145表達水平的高低提示著LSCC的浸潤轉(zhuǎn)移程度。

Ki-67基因是1980年從兔血清中發(fā)現(xiàn)的一種與細胞有絲分裂密切相關的核蛋白，在細胞周期的G1期開始表達并于M期達到峰值[6]。Ki-67能夠在一定程度上反映細胞的增殖程度，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關。本研究結(jié)果顯示，LSCC組織中Ki-67的陽性表達率明顯高于癌旁正常組織，與Gioacchini等[10]和楊光等[11]的研究結(jié)果一致，說明Ki-67在喉癌的發(fā)生和發(fā)展過程中起著促進作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，Ki-67的陽性表達率與LSCC患者的TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關（P＜0.01），而與患者的年齡、性別、腫瘤直徑、分化程度無關（P＞0.05），與楊光等[11]的研究結(jié)果類似，提示Ki-67高表達可能促進LSCC細胞的惡性增殖，加速LSCC細胞的浸潤轉(zhuǎn)移。

survivin基因是1997年發(fā)現(xiàn)的一種位于染色體17q25的凋亡抑制基因，其表達產(chǎn)物是目前發(fā)現(xiàn)的最強的凋亡抑制蛋白，除了胚胎組織外幾乎不表達于任何正常分化的組織，但在肝癌、肺癌、宮頸癌、子宮癌等多數(shù)腫瘤組織中高表達，并與患者的預后密切相關[7]。本研究結(jié)果顯示，LSCC組織中survivin的陽性表達率明顯高于癌旁正常組織，與Marioni等[12]的研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，survivin的陽性表達率與LSCC患者的TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關（P＜0.01），而與患者的年齡、性別、腫瘤直徑、分化程度無關（P＞0.05），與楊光等[11]的研究結(jié)果類似，提示survivin可能通過調(diào)控細胞周期進程，促進LSCC細胞的惡性轉(zhuǎn)化，并加速LSCC細胞的浸潤轉(zhuǎn)移。

表2 miRNA-145、Ki-67、survivin及Aurora-b的陽性表達率與LSCC患者臨床特征的關系

Aurora是1998年發(fā)現(xiàn)的一種與細胞有絲分裂密切相關的絲氨酸/蘇氨酸激酶，包括Aurora-a、Aurora-b、Aurora-c三個成員，其中Aurora-a和Aurora-b對有絲分裂過程中中心體成熟、染色體分離具有明顯的調(diào)控作用。Aurora-b能夠與survivin、內(nèi)著絲粒蛋白、Borealin形成染色體過客復合物，調(diào)控染色體的結(jié)構(gòu)與功能。研究顯示，Aurora-b在多種腫瘤組織中高表達，且以Aurora-b為靶點設計的腫瘤抑制劑也逐漸受到關注[8]。García-Fernández等[13]和胡慈浩等[14]的研究顯示，Aurora-b在LSCC組織中的陽性表達率明顯高于癌旁正常組織，與本研究結(jié)果一致，說明高表達的Aurora-b與LSCC的發(fā)生密切相關。本研究還發(fā)現(xiàn)，Aurora-b與LSCC患者的TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關（P＜0.01），而與患者的年齡、性別、腫瘤直徑、分化程度無關（P＞0.05），提示Aurora-b高表達可能加速了癌細胞有絲分裂的進程，進而加快了癌細胞的增殖速度，最終促進癌細胞的浸潤轉(zhuǎn)移。因此，以Aurora-b作為靶點設計腫瘤小分子抑制劑無需考慮LSCC患者的年齡、性別等臨床特征。

研究顯示，Ki-67與細胞周期進程密切相關，Aurora-b能夠參與細胞的有絲分裂過程，survivin不僅能夠與Aurora-b形成復合物參與細胞的有絲分裂，還能參與細胞周期的調(diào)控過程[6-8]。另有研究顯示，喉癌組織中survivin與Ki-67的表達呈正相關，survivin與Aurora-b的表達呈正相關[11,15]。本研究結(jié)果顯示，LSCC組織中Ki-67、survivin及Aurora-b的表達兩兩之間呈正相關。提示Ki-67、survivin、Aurora-b可能通過調(diào)控細胞周期進程參與喉癌的發(fā)生和發(fā)展，可能成為喉癌診斷的潛在指標。本研究還發(fā)現(xiàn)，LSCC組織中miRNA-145與Ki-67、survivin、Aurora-b的表達均呈負相關，說明miRNA-145作為喉癌的治療靶點，Ki-67與survivin可能是其下游的靶基因之一，但具體機制有待于進一步研究。

綜上所述，miRNA-145在LSCC組織中低表達，Ki-67、survivin、Aurora-b在LSCC組織中高表達，miRNA-145、Ki-67、survivin、Aurora-b的陽性表達率與LSCC患者的TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關，四者聯(lián)合檢測可能成為LSCC診斷的有效指標。

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