他莫昔芬對乳腺癌MCF- 7細胞侵襲能力的影響及其作用機制

王捷，王巖，朱蕓

南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第一附屬醫(yī)院1藥學(xué)部，2外科教研室，3心血管內(nèi)科，河南 南陽473000

乳腺癌是女性惡性腫瘤中占據(jù)比例較大且預(yù)后不佳的生殖系統(tǒng)疾病[1]。乳腺癌的發(fā)病原因與雌激素受體（estrogen receptor，ER）的作用密切相關(guān)[2]。ER表達的乳腺癌被稱為ER陽性乳腺癌[3]。他莫昔芬（Tamoxifen，TAM）可與ER結(jié)合切斷雌激素對乳腺癌細胞的刺激作用，是一種選擇性ER調(diào)節(jié)劑，可阻止癌細胞的生長[4]。但相關(guān)研究表明，僅僅抑制ER是不夠的，TAM具有類似雌激素的作用，能提高血管內(nèi)皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEFG）水平，提高腫瘤組織產(chǎn)生新生血管的能力，促進癌細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移[5]；同時還能提高基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinases-2，MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）水平，協(xié)同增強新生血管的形成能力。本研究探討TAM對乳腺癌MCF-7細胞侵襲能力的影響及其作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞

乳腺癌MCF-7細胞株購自重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)研究實驗室。

1.2 實驗儀器與藥品

高糖DMEM培養(yǎng)基、無酚紅高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；DMSO培養(yǎng)基、TAM、明膠均購自Sigma公司；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及實時熒光定量PCR試劑盒均購自日本TaKaRa公司。儀器中CO2培養(yǎng)箱購自Thermo公司；制膠、電泳和轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，Chemi Doc XRS+凝膠成像系統(tǒng)，CFX Connect實時熒光定量PCR儀均購自Bio-Rad公司。

1.3 細胞培養(yǎng)

MCF-7細胞培養(yǎng)采用含10%的胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 μg/ml鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基在37℃及5%CO2條件下孵育。待細胞融合率達90%時進行傳代培養(yǎng)。

1.4 細胞分組及實驗方法

取對數(shù)生長期MCF-7細胞。給藥前將耗竭細胞本身的內(nèi)源性雌激素改用無血清無酚紅高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。將MCF-7細胞接種至6孔板中，過夜，直至細胞貼壁。設(shè)對照組、TAM組。對照組用無血清無酚紅高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，TAM組用含1 μmol/L TAM的無血清無酚紅高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，每組5個復(fù)孔。

1.5 Western blot法測定MMP- 9、MMP- 2、VEGF蛋白水平

采用BCA蛋白定量法測定MMP-9、MMP-2、VEGF蛋白：向其中加入Loading Buffer在95℃條件下變性15 min，12 000 r/min離心10 min，保存于-80℃冰箱中用于蛋白表達水平檢測。將每孔10 μl樣品加入含10%的十二烷基硫酸鈉（lauryl sodium sulfate，SDS）的聚丙烯凝膠中電泳分離90 min，分離完畢后切膠，制作三明治盒。冰水中轉(zhuǎn)膜2 h。5%脫脂奶粉封閉2 h。一抗（Bcl-2、Bax、Actin，1∶1000）常溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次12 min，二抗（1∶5000）常溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次8 min，加入ECL發(fā)光液后，轉(zhuǎn)入暗室，化學(xué)發(fā)光法曝光感光底片，顯影定影洗滌后烘干裁片保存。

1.6 RT-PCR 法 測 定 MMP- 9、MMP- 2、VEGF mRNA水平

按TRⅠzol試劑說明書要求提取RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件參照TaKaRa M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶說明書。PCR反應(yīng)體系：cDNA1.0 μl，2×Premix Taq 10 μl，上、下游引物各10 pmol，加雙蒸水至總體積20 μl。PCR反應(yīng)條件：94℃5 min預(yù)變性；94℃ 30 s變性，59℃45 s退火，72℃1 min延伸，34個循環(huán)；72℃延 伸 10 min。 β-actin 正 義 引 物 序 列 為 5′-TGGATCCTGTGGCAT-CCATGAAAC-3′，反義引物序列為5′-TAAAACG-CAGTAACAGTCC-3（′350 bp）；Bcl-2正義引物序列為5′-TGCACCTGACGCCCTTCA-3′，反義引物序列為 5′-AGA-CAGCCAGGAGAAATCAAACA-3（′291 bp）；Bcl-xL正義引 物 序 列 為5′-ATGTCTCAGAGCAACCGGGAGC-3′，反義為 5′-GCGATCCGACTCACCAATACCT-3（′500 bp）；XⅠAP正義引物序列為5′-ATGATACCATCTTCCAAAATCC-3′，反 義 為 5′-TTCTGTAATGAAGTCTGACTT-3（′200 bp）。PCR反應(yīng)結(jié)束取產(chǎn)物5 μl于12 g/L瓊脂糖凝膠電泳。采用Quantity One軟件進行分析，以β-actin作為內(nèi)參照，以靶基因與β-actin光密度的比值作為mRNA的表達豐度，進行半定量檢測。

1.7 Transwell法

采用Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力，按照文獻[6]操作。各組MCF-7細胞侵襲能力=穿過Matrigel膠微孔濾膜的細胞數(shù)/空白對照穿過Matrigel膠微孔濾膜的細胞數(shù)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)-計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGF、MMP- 9、MMP- 2蛋白表達水平的比較

TAM組MCF-7細胞中的VEGF、MMP-9、MMP-2蛋白表達水平均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 兩組MCF- 7細胞中VEGF、MMP- 9、MMP- 2蛋白表達水平的比較（%，±s）

表1 兩組MCF- 7細胞中VEGF、MMP- 9、MMP- 2蛋白表達水平的比較（%，±s）

組別對照組TAM組t值P值VEGF 100.4±2.1 157.9±13.6 10.235＜0.01 MMP-9 100.9±3.3 181.2±23.8 8.186＜0.01 MMP-2 100.0±1.6 172.4±21.5 8.226＜0.01

2.2 VEGF、MMP- 9、MMP- 2 mRNA表達水平的比較

TAM 組 MCF-7細胞中的VEGF、MMP-9、MMP-2mRNA相對表達水平均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。（表2）

表2 兩組MCF- 7細胞中VEG-F、MMP- 9、MMP- 2 mRNA相對表達水平的比較（x± s）

2.3 細胞侵襲能力的比較

TAM組MCF-7細胞的侵襲能力相對數(shù)為（34.9±5.9），明顯高于對照組的（12.6±3.4），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.022，P＜0.01）。（圖1）

圖1 兩組MCF- 7細胞侵襲實驗結(jié)果（HE染色，×400）

3 討論

乳腺癌是臨床上常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，對中國女性的健康危害極大。目前常采用內(nèi)分泌治療并取得較滿意的效果。雌激素通過調(diào)節(jié)或拮抗經(jīng)典的雌激素受體ER-α、ER-β所參與的各個生理過程來實現(xiàn)降低乳腺癌細胞中抗凋亡的Bcl-2表達，增加促凋亡的Bax表達能力，從而促使癌細胞凋亡[7]。TAM為一種非固醇類ER拮抗藥，通過競爭性抑制ER發(fā)揮抑制增殖分化的能力從而治療乳腺癌[8]。但近年來的研究發(fā)現(xiàn)，TAM也發(fā)揮類似雌激素作用[8]，主要體現(xiàn)在其活性代謝產(chǎn)物4-羥基他莫昔芬（4-OHT）具有雌激素樣作用，可促進ER-α陰性乳腺癌SR-BR-3細胞的增殖，同時可增強子宮內(nèi)膜癌Tshikawa和KLE細胞的增殖與侵襲能力，提高其MMP-9、MMP-2蛋白及MMP-9、MMP-2mRNA的表達和活性[9]。提示拮抗ER-α受體治療乳腺癌具有一定的局限性，需輔助抑制相關(guān)雌激素樣作用，降低不良反應(yīng)發(fā)生率。

腫瘤組織生長的關(guān)鍵是形成新生血管。VEGF是一種具有強作用的促血管內(nèi)皮細胞分裂劑[10]。與相應(yīng)受體結(jié)合后刺激血管內(nèi)皮細胞增生，形成新的血管和基質(zhì)。研究報道，VEGF表達與乳腺癌預(yù)后有關(guān)，高水平的VEGF可促進乳腺癌遠處轉(zhuǎn)移[11]。有學(xué)者認為乳腺癌中VEGF的表達與MMP-2、MMP-9有關(guān)，提示VEGF、MMP-2、MMP-9在乳腺癌中協(xié)同刺激腫瘤血管形成，促進細胞外基質(zhì)的降解和癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移[12]。本研究結(jié)果顯示，TAM組MCF-7細胞中的VEGF、MMP-9、MMP-2蛋白表達水平均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；TAM組MCF-7細胞中的VEGF、MMP-9、MMP-2mRNA相對表達水平均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），說明TAM在拮抗ER-α受體的同時，發(fā)揮雌激素樣作用，促進乳腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，影響預(yù)后效果。

目前研究TAM的耐藥機制可能為：①ER-α的突變與缺失，主要由于部分耐藥腫瘤細胞編碼ER-α 351位酪氨酸基因突變，被天冬氨酸占據(jù)。②ER-β表達的變化，李鵬程等[13]報道由Fos-Jun異源二聚體與Jun-Jun同源二聚體組成的AP-1轉(zhuǎn)錄因子，通過AP-1位點途徑的作用，使ER-β異常激活或過度表達，引起乳腺癌患者耐藥現(xiàn)象的發(fā)生。③生長因子信號通路激活ER，ER和生長因子受體通路之間存在相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者中ER-α、ER-β的高表達可增加生長因子信號蛋白（EGFR/HER2）及下游MAPK的活性，通過EGFR-Ras-Raf-MAPK磷酸級聯(lián)反應(yīng)，使ER A/B區(qū)的第118位絲氨酸磷酸化，ER以配體非依賴性的方式被激活[14]。④細胞激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變，PⅠ3K/AKT/MTOR和MAPK/EPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細胞內(nèi)重要的傳導(dǎo)通路，與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。MAPK和AKT作為重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子可發(fā)揮抑制細胞凋亡、促進細胞增殖的作用，可直接激活ER，是導(dǎo)致內(nèi)分泌治療耐受的關(guān)鍵原因。

本研究結(jié)果顯示，TAM組MCF-7細胞的侵襲能力相對數(shù)明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），其機制可能與提高Bcl-2表達水平，降低BAX水平有關(guān)。在不利因素環(huán)境下，細胞會在基因調(diào)控下發(fā)生自動死亡，此過程為凋亡，對維持細胞正?；顒泳哂兄匾饬x。凋亡過程與Bcl-2家族和促凋亡蛋白（BAX）關(guān)系密切。Bcl-2可維持線粒體外膜的完整性，防止線粒體內(nèi)細胞色素C等促凋亡分子進入細胞。BAX則可破壞線粒體外膜的完整性，促進各種凋亡分子進入細胞，發(fā)揮促凋亡作用。正常情況下，Bcl-2和BAX形成二聚體，作為調(diào)控細胞凋亡過程的開關(guān)。當外界條件刺激，二聚體分離，抑制細胞出現(xiàn)凋亡，繼而引發(fā)腫瘤。已有研究證實，TAM作用于MCF-7細胞可提高乳腺癌細胞中Bcl-2表達水平，降低BAX表達水平[15]。與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，TAM可能發(fā)揮類雌激素功能，促進乳腺癌MCF-7細胞侵襲能力，這與其提高MCF-7細胞中VEGF、MMP-9、MMP-2蛋白表達有關(guān)。

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