木犀草素氨基醌抑菌活性和酶抑制活性

王 建，陶傳洲,孫 威，蘇珍妮，王 麗，史天智，馬曉東，劉瑋煒，史大華，朱 強

(1.淮海工學(xué)院 化工學(xué)院，江蘇 連云港 222005；2.淮海工學(xué)院 藥學(xué)院，江蘇 連云港 222005；3.淮海工學(xué)院 研究生處，江蘇 連云港 222005;4.淮海工學(xué)院 海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇 連云港 222005)

木犀草素1普遍存在于植物中，具有多種生化和藥理作用[1]，化學(xué)名為3′,4′,5,7-四羥基黃酮，各個環(huán)上酚羥基活性相差較大，B環(huán)酚羥基活性最高，C環(huán)為色原酮結(jié)構(gòu)，其上的羥基活性其次，A環(huán)酚羥基活性最弱。因此,在木犀草素的結(jié)構(gòu)中，使其具有生理活性的是A環(huán)和B環(huán)上的酚羥基和C環(huán)上的α、β-不飽和環(huán)酮結(jié)構(gòu)。目前，對木犀草素結(jié)構(gòu)修飾主要集中在對 C2、C3、C6、C8、C3′(或 C5′)和C4′等位進行的化學(xué)改性，引入鹵素、烷氧基、芳基、吡啶基、氨基、羧基、磺酸基和磷酸基等基團來改善溶解性，提高生物活性和生物利用度。楊洋等[2]測定了花生殼木犀草素的抑菌特性，結(jié)果表明：木犀草素對傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和痢疾桿菌表現(xiàn)出抑菌活性，對啤酒酵母有抑制作用，而對大腸桿菌無效;其抑菌活性強于同質(zhì)量濃度的山梨酸和亞硝酸鈉。周建新等[3]研究了不同溶劑及輔助方法對木犀草素含量及金黃色葡萄球菌抗菌作用的影響，結(jié)果表明：隨著木犀草素質(zhì)量濃度的增加，抗菌作用越顯著。

目前，國內(nèi)外都是在不損害木犀草素活性的基礎(chǔ)上，通過化學(xué)方法進行結(jié)構(gòu)修飾，或通過衍生化反應(yīng)改變其溶解度，或引入親水基團以提高水溶性[4]。沙靖全等[5]以木犀草素和磺胺甲惡唑進行縮合反應(yīng)制成新的黃酮席夫堿化合物,并以此為配體合成了新的金屬配合物，進行抗菌活性實驗。結(jié)果表明：配體和配合物都對金黃葡萄球菌B1、大腸桿菌B2、白色念珠菌B3、枯草桿菌B4和變形桿菌B5等菌株有明顯的抑菌活性，且優(yōu)于各自的母體,形成配合物后抑菌活性大大增強。周美榮等[6]以木犀草素為先導(dǎo)化合物,利用二甲苯誘發(fā)小鼠耳廓腫脹模型對所合成的7個8-氨甲基化衍生物進行抗炎活性的藥理篩選,結(jié)果表明：部分化合物具有良好的抗炎活性,能明顯減輕二甲苯致小鼠耳廓炎癥反應(yīng),腫脹度與陰性組比較具有顯著差異性,其活性亦高于母體化合物木犀草素的活性。

木犀草素為多酚分子，在其6′位引入氨基未見報道。筆者通過控制一定酸度，用空氣將木犀草素氧化為相應(yīng)的鄰醌化合物[7]，再由α,β-不飽和羰基與氨基化合物進行親核加成反應(yīng)，將脂肪族伯、仲胺氨基結(jié)構(gòu)單元引入木犀草素醌環(huán)(B環(huán))上6′位，既起到增強藥效的作用,又可以對整個分子的脂/水分布系數(shù)作出調(diào)整，影響先導(dǎo)化合物的藥代動力學(xué)參數(shù),并做出改善。

關(guān)于阿爾茨海默癥(Alzheimer′s disease,AD)的治療大多離不開膽堿能學(xué)說[8]。按照膽堿酯酶(cholinesterase,ChE)對底物特異的催化作用，將其分為2種，第一種是乙酰膽堿酯酶(AChE),第二種是丁酰膽堿酯酶(BuChE)。不過目前已經(jīng)批準上市的乙酰膽堿酯酶抑制劑藥物有很多局限性。李俊杰[9]通過臨床治療發(fā)現(xiàn)：患者長期服用乙酰膽堿酯酶抑制劑類藥物出現(xiàn)不良反應(yīng)時，將藥物換作雙重膽堿酯酶抑制劑，病情會穩(wěn)定下來，認知水平也會得到很好的控制。所以，改善AD患者的臨床治療可以從發(fā)展特異性的丁酰膽堿酯酶抑制劑或雙重ChE抑制劑著手。美國 FDA已批準通過的用于治療AD的藥物僅有一類，即AChE抑制劑。目前已經(jīng)批準上市的有4種藥物都包含生物堿類化合物[10]。但是它們都有許多副作用，比如半衰期短，容易造成患者胃、肝不適等，故其廣泛應(yīng)用受到很大限制。因此,從天然植物及其衍生物中發(fā)掘出可以根除疾病、毒副作用小的乙酰膽堿酯酶抑制劑是當(dāng)前主要的研究方向。探尋可對丁酰膽堿酯酶產(chǎn)生抑制作用的抑制劑也已經(jīng)發(fā)展成為一種新的治療AD的途徑。目前關(guān)于木犀草素對AD的治療作用未見報道，本研究以木犀草素為參照物，使用自制水溶性氨基木犀草素醌系列化合物進行相關(guān)實驗，以期為此類新的具有較強抗自由基能力化合物的應(yīng)用開拓更廣泛的領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

304材質(zhì)牛津杯，上海化科實驗器材有限公司；YXQ-LS-30S11型高壓滅菌鍋，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SHP-250型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海實驗儀器總廠；TS-1102型振蕩雙層培養(yǎng)搖床，常州市國旺儀器制造有限公司；SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺，BXM-50VE型立式壓力蒸氣滅菌器，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；GL124-1SCN型電子分析天平，德國賽多利斯公司；WH-2型旋渦振蕩器，常州華奧儀器制造有限公司。

金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌和大腸埃希氏菌均來自淮海工學(xué)院海洋生物技術(shù)實驗室；乙酰膽堿酯酶活性檢測試劑盒、丁酰膽堿酯酶、β-羥丁酸脫氫酶(來源于勒氏假單胞菌，凍干粉，活性≥200 U/mg)，美國Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 木犀草素醌的制備

木犀草素為主要原料，具有4個酚羥基，通過控制pH可使其主要氧化生成鄰位醌式結(jié)構(gòu)化合物，測得最適pH為9.2，反應(yīng)式見圖1。

1.2.2 氨基木犀草素醌的合成

醌式結(jié)構(gòu)化合物再與胺類反應(yīng)合成基于木犀草素結(jié)構(gòu)的18個醌類化合物。對其進行紅外(IR)、紫外(UV)、質(zhì)譜和核磁表征[11]，反應(yīng)式見圖2，結(jié)構(gòu)如圖3所示。

1.2.3 抑菌實驗原理

本實驗采用抑菌圈法，利用待測樣品在瓊脂平板中擴散，使其周圍的細菌生長受到抑制而形成透明圈，根據(jù)抑菌圈大小判定待測樣品抑菌效價。

圖1 木犀草素被氧化的反應(yīng)式Fig.1 Reaction equation of luteolin by oxidation

圖2 木犀草素的鄰醌類化合物與胺類的反應(yīng)式Fig.2 Reaction equation of the luteolin’s o-quinone with amines

圖3 被測樣品的分子結(jié)構(gòu)Fig.3 Molecular structure of samples tested

1.2.4 總巰基檢測試劑盒法(Ellman 法)

Ellman法屬于一種測試小分子化合物抑制膽堿酯酶活性的方法，能定量評價AChE或BuChE抑制活性。原理是硫代乙酰膽堿(硫代ACh)或硫代丁酰膽堿(硫代BuCh)被AChE或BuChE水解，從而得到硫代膽堿。硫代膽堿可和5,5′-二硫代雙-(2-硝基苯甲酸)(顯色劑,DTNB)結(jié)合，得到5-硫-2-硝基苯甲酸，呈黃色。5-硫-2-硝基苯甲酸在波長 412 nm處顯示出最大紫外吸收。當(dāng)化合物對酶產(chǎn)生抑制作用時，活性降低，其水解硫代ACh或硫代BuCh的水平降低，水解產(chǎn)生的硫代膽堿濃度都會有所減少，硫代膽堿與DTNB反應(yīng)生成的 5-硫-2-硝基苯甲酸含量會相應(yīng)減少，在 412 nm 處顯示出吸光度降低。抑制率的大小可根據(jù)吸光度變化數(shù)值計算，其反應(yīng)式如圖4所示。

圖4 硫代乙酰膽堿被AChE水解得到硫代膽堿及其和DTNB的顯色反應(yīng)Fig.4 Thioacetylcholine is hydrolyzed by AChE to give thiocholine and its colour reaction with DTNB

1.3 實驗過程

1.3.1 培養(yǎng)基的制備

用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌[12]；液體培養(yǎng)基中不添加瓊脂即可[13]。牛肉膏蛋白胨(NB)培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，魚粉蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15.0～20.0 g，將pH調(diào)至7.2～7.4，補水至1 000 mL，分裝至三角瓶中，脫脂棉封口包扎，靜置數(shù)分鐘，待冷卻。在高壓滅菌鍋內(nèi)進行滅菌，溫度設(shè)定為121.0 ℃，時間為25 min。

1.3.2 試驗細菌的活化

將溫度冷卻至約70 ℃時，在無菌環(huán)境下將培養(yǎng)基傾倒至平板中，高度約為平板的1/4。待培養(yǎng)基凝固，從試驗菌的保藏斜面中用灼燒過的接種針取出少量菌體，在平板內(nèi)劃線傳代(代數(shù)2次為相對穩(wěn)定)。將劃好的平板倒置于恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，溫度設(shè)定為37 ℃，經(jīng)過1～2 d培養(yǎng)，即可看出菌體的生長。

1.3.3 菌懸液制備

預(yù)先制備NB液體培養(yǎng)基，即不添加瓊脂，體積為試管的1/4～1/3，包好后進行滅菌，設(shè)定條件和固體培養(yǎng)基一樣，待冷卻。無菌環(huán)境下用接種環(huán)從平板中挑取純種單菌落，將菌落接入液體培養(yǎng)基中，每個試管接2～3環(huán)。將試管綁好，安放在振蕩雙層培養(yǎng)搖床中，溫度設(shè)定為37 ℃，轉(zhuǎn)速設(shè)定為150 r/min。

1.3.4 樣品的處理

對樣品做好編號進行標(biāo)記。只有2號、12～18號8個產(chǎn)物在二甲基亞砜(DMSO)中溶解性較好，其余較難溶解。故選擇無菌水為溶劑，溶解配比為1 mg藥品對應(yīng)1 mL無菌水。

1.3.5 加入樣品測定實驗

取出液體培養(yǎng)基，經(jīng)過振蕩器充分振蕩，用移液槍取0.1 mL菌懸液注入NB培養(yǎng)基平板中，用涂布棒涂布均勻。將牛津杯經(jīng)酒精燈灼燒1～2 s，放置在3個涂布過的平板上，成等邊三角形。移液槍取出0.1 mL樣品注入牛津杯中，在操作臺中放置20 min后，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d左右。同時以無菌水作為溶劑的空白實驗。

1.3.6 結(jié)果的記錄

待有效果樣品對試驗菌產(chǎn)生明顯的抑菌圈后，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈半徑。

1.3.7 Ellman 法測試膽堿酯酶的抑制作用

包括木犀草素對照物在內(nèi)18個產(chǎn)物，采用 Ellman法分別進行體外ChE抑制作用檢測。

1) 緩沖液的配制 pH為8.0的H3PO4緩沖液：稱取71.64 g Na2HPO4，加去離子水，用1 000 mL容量瓶定容；稱取31.21 g NaH2PO4，加去離子水，用1 000 mL容量瓶定容；分別量取947 mL Na2HPO4溶液和53 mL NaH2PO4溶液，加去離子水定容至1 000 mL。

2) 顯色劑及底物的配制 量取0.013 2 g顯色劑DTNB，加上述H3PO4緩沖液定容至10 mL，稱取0.015 3 g底物碘化硫代乙酰膽堿(C7H16INOS，ATCI)，加上述配好的H3PO4緩沖液定容至10 mL。

3) 樣品的配制 每種樣品分別稱取1 mg，加適量DMSO或水配制成1 mg/mL的樣品液。

4) 96孔加樣檢測 通過96孔板檢測樣品的AChE的抑制活性?？瞻讓φ辗磻?yīng)體系中加入20 μL酶液(乙酰膽堿酯酶或丁酰膽堿酯酶)、20 μL顯色劑DTNB和130 μL H3PO4緩沖液；待測實驗組反應(yīng)體系中加入20 μL酶液(乙酰膽堿酯酶或丁酰膽堿酯酶)、20 μL顯色劑DTNB、130 μL H3PO4緩沖液和10 μL樣品液。臨測前加入20 μL底物液碘化硫代乙酰膽堿(ATCI),搖晃混勻置于酶標(biāo)儀中，在波長412 nm下，每隔1 min記錄反應(yīng)液的吸光度A412值，循環(huán)9次，持續(xù)8 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 抑菌活性的測定實驗結(jié)果

抑菌活性的測定實驗數(shù)據(jù)如表1所示。編號為2、4、5、14的氨基木犀草素醌在大腸桿菌中抑菌活性如圖5所示。由表1和圖5可知：抑菌圈半徑分別為0.678、0.650、0.730和0.680 cm。

表1 抑菌活性測定實驗數(shù)據(jù)

注：①大腸為大腸埃希氏菌,枯草為枯草芽孢桿菌,金葡為金黃色葡萄球菌;②當(dāng)抑菌圈不明顯時，表中以抑菌圈半徑為“-”標(biāo)示。

圖5 編號為2、4、5和14的樣品在大腸桿菌的抑菌活性Fig.5 Antibacterial activity of the samples No. 2,4,5 and 14 in Escherichia coli

在金黃色葡萄球菌中只有7號有抑菌活性(圖6)，抑菌半徑為0.600 cm；而在枯草芽孢桿菌中，所有的藥品都不存在抑菌活性。

圖6 編號為7的樣品在金黃葡萄球菌中的抑菌活性Fig.6 Antibacterial activity of sample No. 7 in Staphylococcus aureus

由抑菌圈可判斷出，只有4種氨基木犀草素醌對大腸桿菌存在抑菌活性，但并不能從抑菌圈半徑判斷出其抑菌能力，因為測定結(jié)果受樣品溶解性和擴散能力影響很大，具有一定局限性；同時只有一種氨基木犀草素醌對金黃色葡萄球菌存在抑菌活性；而對枯草芽孢桿菌，沒有任何氨基木犀草素醌對其有抑菌作用。

2.2 酶抑制活性的實驗

測得的樣品抑制率如表2所示，抑制率以式(1)方法計算。

表2 樣品酶的抑制率

注：序號1為木犀草素，因其在水中難以溶解，因此不做測試。

抑制率=(1-實驗孔平均OD值/對照孔平均OD值)×100%=(1-C/0.016)×100%

(1)

式中：C為測得的每個樣品液的實驗孔平均A412值。

由表2可知：只有3、13～19號樣品在DMSO中的溶解性較好，可進行乙酰膽堿酯酶活力檢測。除17號對乙酰膽堿酯酶的抑制率稍高，其余均較低。抑制率最高的產(chǎn)物17和其次產(chǎn)物14抑制率分別為71.07%和16.88%。前者抑制率超過50%，活性較高，可以通過測定半抑制濃度(IC50)，以IC50對抑制活性做定量測定。后者低于50%，則測定無意義。以無菌水為溶劑，進行丁酰膽堿酯酶活力檢測時，18個樣品對丁酰膽堿酯酶抑制率均較低，其中抑制率最高的是產(chǎn)物11，其次是產(chǎn)物9。目前主流研究認為體內(nèi)乙酰膽堿含量與AD的癥狀改善顯著相關(guān)[14]。堿酯酶抑制率越高，說明乙酰膽堿保留越多。

3 結(jié)論

1)以木犀草素為對照，探究18種基于木犀草素結(jié)構(gòu)的氨基醌化合物的抑菌活性，通過觀測抑菌環(huán)的方法，發(fā)現(xiàn)其中只有2、4、5、14號樣品對大腸桿菌有抑菌活性，抑菌圈半徑分別為0.678、0.650、0.730和0.680 cm,但效果有限；對金黃色葡萄球菌有抑菌活性的化合物只有7號樣品，抑菌半徑為0.600 cm；而對于枯草芽孢桿菌，所有化合物都無抑菌效果。因此，無一種化合物對3種菌類都具有抑制作用。

2)合成的氨基醌類化合物中只有3、13～19號樣品的8個產(chǎn)物在DMSO中的溶解性較好，可進行乙酰膽堿酯酶活力檢測。除產(chǎn)物17對乙酰膽堿酯酶的抑制率較高，其余都很低。抑制率最高的是產(chǎn)物17，其次是產(chǎn)物14，抑制率分別為71.07%和16.88%。前者抑制率超過50%，活性較高，可以通過抑制IC50對抑制活性進行定量測定；后者低于50%則測定IC50無意義。在進行丁酰膽堿酯酶活力檢測時，溶劑為無菌水，結(jié)果18個樣品對丁酰膽堿酯酶抑制率都很低。其中抑制率最高的是產(chǎn)物11，其次是產(chǎn)物9。

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