嘧啶結(jié)構(gòu)骨架類抗瘧藥研究進(jìn)展

丁奇峰，賀常虹，談嘉怡，岳慧慧，薛 蘞，于 楊，黃 和，黃 菲

(南京工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 211800)

瘧疾是一種由瘧原蟲感染而引起的，能夠危及人類生命的疾病。如今每年由瘧原蟲感染的病例達(dá)到2億之多，并可造成超過(guò)438 000人死亡，且瘧疾在非洲尤為嚴(yán)重，是非洲兒童和婦女主要的死亡原因之一[1]?，F(xiàn)如今隨著科技以及醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展，瘧疾發(fā)病率以及致死率都在逐年遞減，然而對(duì)惡性瘧原蟲卻一直找不到有效的解決辦法。惡性瘧原蟲已經(jīng)對(duì)多種抗瘧藥(氯喹、奎寧等)產(chǎn)生了耐藥性，其發(fā)病兇險(xiǎn)，愈后差，致死率高達(dá)50%[2]，嚴(yán)重威脅著人類生命健康，阻礙社會(huì)的發(fā)展。

瘧原蟲生命周期復(fù)雜，總的來(lái)看瘧原蟲的生命周期主要包括4個(gè)階段：蚊蟲傳播階段、肝臟階段、血液階段以及性成熟階段(圖1[3])。蚊蟲叮咬將唾液中的瘧原蟲引入人體血液中，此后瘧原蟲到達(dá)肝臟和血液以逐漸成熟和繁殖。瘧原蟲在不同階段都可以產(chǎn)生不同的表面抗原以逃避宿主的免疫清除，因此針對(duì)其每個(gè)階段都必須考慮相應(yīng)對(duì)的辦法，以根除這種疾病。常見(jiàn)可寄生于人類的瘧原蟲有4種，即：間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、三日瘧原蟲和惡性瘧原蟲，它們分別可引起間日瘧疾、卵形瘧疾、三日瘧疾和惡性瘧疾。前3種瘧疾目前都能得到有效的治療，而惡性瘧疾由于其發(fā)病的兇險(xiǎn)性則一直是醫(yī)學(xué)界難以攻破的課題。

鑒于全球惡性瘧原蟲已經(jīng)對(duì)傳統(tǒng)抗瘧藥氯喹產(chǎn)生了耐藥性，在瘧疾流行地區(qū)，媒介控制以及化學(xué)治療是目前控制惡性瘧疾的主要對(duì)策。媒介控制通過(guò)使用殺蟲劑處理過(guò)的蚊帳以及清除生活區(qū)的停滯水等方法[4]；化學(xué)治療包括殺滅無(wú)性寄生蟲以及對(duì)宿主采用支持療法以增強(qiáng)其免疫力等方法來(lái)扼制惡性瘧疾的蔓延。然而，瘧疾現(xiàn)今的發(fā)病形勢(shì)依舊非常嚴(yán)峻，青蒿素及其衍生物雖然具有高效和低毒的特點(diǎn)，并可有效對(duì)抗惡性瘧原蟲，但是在東南亞地區(qū)已經(jīng)出現(xiàn)了惡性瘧原蟲青蒿素耐藥性的案例[5-7]。因此，針對(duì)其耐藥性，開(kāi)發(fā)出更具抗性特點(diǎn)的新型抗瘧藥已迫在眉睫。

圖2 苯并嘧啶類化合物結(jié)構(gòu)Fig.2 Benzopyrimidine compounds structure diagram

嘧啶類抗瘧藥大多作用于瘧原蟲的二氫葉酸還原酶(DHFR)，實(shí)現(xiàn)對(duì)該酶活性的抑制，從而阻斷瘧原蟲四氫葉酸的合成途徑，并由此發(fā)揮抗瘧活性。按化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同，將近10年來(lái)這類化合物在抗瘧活性及其構(gòu)效關(guān)系(SAR)等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

圖1 瘧原蟲的傳播階段示意圖Fig.1 Schematic diagram for parasite transmission stage

1 苯并嘧啶類化合物

在20世紀(jì)60年代就有報(bào)道稱苯并嘧啶類化合物具有重要的抗瘧活性[8]，其嘧啶環(huán)上通常具有2個(gè)胺基，苯環(huán)上可引入各種不同的取代基。因此可以在苯并嘧啶骨架上引入不同的基團(tuán)，以尋找可以克服耐藥性的新化合物。

Paul等[8]通過(guò)高通量篩選，得到一系列苯并嘧啶類化合物，并對(duì)其抗瘧活性進(jìn)行了初步的分析?；衔?為篩選得出的代表化合物(圖2)。經(jīng)活性測(cè)試，化合物1對(duì)氯喹敏感的惡性瘧原蟲(3D7)的半抑制濃度(IC50)為0.106 μmol/L，對(duì)氯喹耐受的惡性瘧原蟲(W2)IC50為0.715 μmol/L，這說(shuō)明該化合物具有很強(qiáng)的抗瘧潛質(zhì)。在這類化合物中，哌啶環(huán)上的取代基對(duì)抗瘧活性的影響特別重要?；衔?中哌啶環(huán)對(duì)位上的甲基若調(diào)到鄰位上形成化合物2，則其活性大大降低(對(duì)3D7的IC50為0.205 μmol/L，對(duì)W2的IC50大于1.25 μmol/L)。另外，Plouffe等[8]還進(jìn)行了構(gòu)效關(guān)系的探究，如圖3所示：中間的骨架結(jié)構(gòu)代表這類抗瘧化合物，右上角的骨架代表還原型輔酶——NADPH，其余螺旋條帶結(jié)構(gòu)代表惡性瘧原蟲的二氫葉酸還原酶(DHFR)，從圖3可以看出：這類化合物與DHFR受體活性中心結(jié)合效果較好，因此具有一定的抗瘧活性。

圖3 化合物1、2的構(gòu)效關(guān)系Fig.3 Structure-activity relationship of compounds 1,2

Malmquist等[9]從已知的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑-BIX-01294(化合物3)出發(fā)，改造得到TM2-115(化合物4)。這2種化合物不同于傳統(tǒng)的嘧啶類化合物作用機(jī)制，它們能抑制組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，使甲基不能轉(zhuǎn)移到特定氨基酸的位置上[10]，從而影響組蛋白正常的功能。鑒于組蛋白的賴氨酸甲基化過(guò)程在瘧原蟲的分化和增殖過(guò)程中至關(guān)重要，因此這類化合物可能具有的一個(gè)最大優(yōu)勢(shì)是對(duì)瘧原蟲生命周期的所有階段都具有抑制作用。此外，化合物3可以用來(lái)參與干細(xì)胞的調(diào)制[11-12]，在提高藥物效力、選擇性和細(xì)胞通透性方面也具有很好的潛力[13-18]。在抗瘧活性方面，化合物3對(duì)W2(耐氯喹)、7G8(耐氯喹和乙胺嘧啶)和Dd2(耐氯喹、甲氟喹和乙胺嘧啶)這3種耐藥性瘧原蟲均具有良好的抑制作用(IC50分別為52、40 和72 nmol/L)，其衍生化合物4也具有相似活性。

Paul等[4]通過(guò)高通量篩選得到化合物5，并基于化合物5的結(jié)構(gòu)進(jìn)行多方位的改造，得到56個(gè)化合物，并具體分析了其構(gòu)效關(guān)系及抗瘧活性。如R1位置上單取代胺基基團(tuán)(如5(a)和5(b))對(duì)抗瘧活性是至關(guān)重要的(圖2)。另外，甲氧基在苯環(huán)上的不同取代位點(diǎn)對(duì)活性也有較大影響。當(dāng)甲氧基在R3及R4位置上時(shí)，其具有較好活性，半最大效應(yīng)濃度(EC50)分別為124 和230 nmol/L；而當(dāng)甲氧基在R2位置上時(shí)，其EC50為526 nmol/L，活性大大減弱。此外苯環(huán)上雙取代甲氧基也不利于其抗瘧活性。當(dāng)在R4位置上引入鹵素(Br、Cl和F)時(shí)，活性有所提升(EC50分別為125、113 和112 nmol/L)，值得一提的是其選擇性同時(shí)也得到很大程度的提高，選擇指數(shù)(SI)分別為153、71和43。Paul等[4]還將R1位置引入芐胺，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：整體活性仍有所保留，這樣可以在R4位置上引入所需基團(tuán)來(lái)改善化合物整體的物理化學(xué)性能。例如，當(dāng)R1為芐胺，R4位置為甲氧基時(shí)，該化合物的疏水常數(shù)有所提高，水溶性也得到有效改善。為進(jìn)一步改善疏水常數(shù)、溶解度以及選擇性，Chang等[17]將與嘧啶合并的苯環(huán)改成吡啶環(huán)，R1位置為芐胺，R4位置為F，得到性能更優(yōu)良的結(jié)構(gòu)，其SI為320，疏水常數(shù)為4.6。在對(duì)構(gòu)效關(guān)系和理化性質(zhì)進(jìn)行探索之后，綜合測(cè)試了各類化合物的抗瘧活性，發(fā)現(xiàn)化合物6擁有更全面的良好性能，其對(duì)惡性瘧原蟲的EC50為26 nmol/L，SI為240，疏水常數(shù)為4.2。

2 胺基嘧啶類化合物

2.1 二胺基嘧啶類化合物

二胺基嘧啶類化合物指的是在嘧啶環(huán)的2個(gè)位置上含有胺基基團(tuán)的化合物。Yuthavong等[19]針對(duì)瘧原蟲二氫葉酸還原酶發(fā)生突變而產(chǎn)生耐藥性的情況進(jìn)行了深入的研究，化合物7～9是其研究的主要化合物(圖4)。該團(tuán)隊(duì)初步研究就發(fā)現(xiàn)了化合物7對(duì)突變型的瘧原蟲二氫葉酸還原酶具有較高活性(IC50=18 nmol/L)，然而小鼠口服的生物利用度卻很差。因此，對(duì)化合物7進(jìn)行改造得到化合物8和9。對(duì)比這2個(gè)化合物發(fā)現(xiàn)：化合物9對(duì)突變型的瘧原蟲活性較好(IC50=56 nmol/L)，且生物利用度大大提高。此外，他們還對(duì)化合物9與二氫葉酸還原酶的結(jié)合方式進(jìn)行了研究，通過(guò)蛋白質(zhì)晶體衍射的手段得到圖4(b)所示的構(gòu)效關(guān)系圖。從圖4(b)可以看出：化合物9與瘧原蟲突變的酶有著部分的連接，而與人類的酶則無(wú)此類連接，說(shuō)明化合物9具有一定的選擇性?？偟膩?lái)說(shuō)，化合物9對(duì)瘧原蟲的二氫葉酸還原酶的抑制遵循緊密結(jié)合-緩釋動(dòng)力學(xué)，其中抑制劑在酶的緊密結(jié)合構(gòu)象狀態(tài)上具有長(zhǎng)的停留時(shí)間。這項(xiàng)研究還表明：化合物9不僅具有對(duì)野生型和耐藥型瘧疾有效的體外和體內(nèi)抗瘧活性，而且還有合適的藥理學(xué)、藥物代謝和安全性特征，因此可被進(jìn)一步臨床開(kāi)發(fā)使用。

圖4 化合物7～9結(jié)構(gòu)圖(a)，化合物9的構(gòu)效關(guān)系(b)Fig.4 Structure diagram for compounds 7-9 (a)， structure-activity relationship of compound 9 (b)

圖5 三胺基取代嘧啶類化合物構(gòu)效關(guān)系Fig.5 Structure-activity relationship diagram of triamino substituted pyrimidines

2.2 三胺基嘧啶類化合物

三胺基嘧啶類化合物是指在嘧啶環(huán)的2、4和5位置上含有胺基基團(tuán)的化合物，其各個(gè)胺基上又可被不同基團(tuán)所取代，因此該類化合物種類多樣，藥效活性也各有差異。Srivastava等[20]經(jīng)過(guò)篩選得到一系列三胺基嘧啶類化合物，并發(fā)現(xiàn)這類化合物擁有較長(zhǎng)的半衰期，對(duì)惡性瘧原蟲效果較好，且在體外情況下不易自身產(chǎn)生耐藥性。他們對(duì)此系列化合物構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行了具體分析，結(jié)構(gòu)與相關(guān)數(shù)據(jù)見(jiàn)圖5?；衔?0為其經(jīng)高通量篩選所得的目標(biāo)化合物，其抗瘧活性、溶解度(solubility)以及對(duì)心臟離子通道(hERG)毒性都有待優(yōu)化。經(jīng)苯環(huán)上烷基取代的轉(zhuǎn)變，得到化合物11，發(fā)現(xiàn)部分參數(shù)得到優(yōu)化但其抗瘧活性則大大降低，因此須進(jìn)行進(jìn)一步的改造。對(duì)化合物12來(lái)說(shuō)，吡唑以及乙基的引入使對(duì)乙酰膽堿酯酶(AChE)的抑制作用增強(qiáng)，抗瘧活性也有所增加。再次改造得到化合物13，其在C5上取代有N-甲基哌嗪，并且還引入了環(huán)丙基，具有最優(yōu)的抗惡性瘧原蟲活性(IC50=9 nmol/L)、極好的溶解性(solubility>1 000 μmol/L)，大鼠生物利用度(Rat F為80%)與化合物12相比也有很大提高。此外，化合物13對(duì)心臟離子通道以及乙酰膽堿酯酶抑制作用較弱(hERG IC50=33 μmol/L,AChE IC50>75 μmol/L)，因此毒性較弱。綜合分析，化合物13顯示了良好的體內(nèi)安全性以及與其他藥物聯(lián)合使用的抗瘧潛力，因此可成為被臨床測(cè)試的候選藥物。

圖7 噻吩并嘧啶類化合物結(jié)構(gòu)Fig.7 The structure of thienopyrimidine compounds

3 喹啉并嘧啶類化合物

喹啉類骨架化合物曾被廣泛應(yīng)用于治療瘧疾，而嘧啶類骨架化合物則具有多種生物活性，例如：殺菌[21]、除草[22]、鎮(zhèn)痛[23]、抗炎[24]和抗腫瘤[25]。Galmarini等[25]通過(guò)二胺基烷烴將喹啉與嘧啶相連，使得該分子具有足夠的靈活性以適應(yīng)目標(biāo)的結(jié)合位點(diǎn)，因此可能會(huì)得到具有更佳抗瘧活性的雜合分子。Sunny等[26]主要分析了22種化合物的構(gòu)效關(guān)系，化合物14為抗瘧活性較好的一類化合物(圖6)。在14(a)結(jié)構(gòu)中，n=1,R為N-甲基哌嗪；14(b)結(jié)構(gòu)中，n=2,R為N-乙基哌嗪。這兩者對(duì)氯喹敏感瘧原蟲以及氯喹耐受瘧原蟲均具有很高的活性，且選擇性都較高。此外，他們還研究了喹啉與嘧啶之間碳鏈長(zhǎng)度對(duì)活性的影響，發(fā)現(xiàn)碳鏈長(zhǎng)度對(duì)活性影響不大。而R基對(duì)活性有較大影響，結(jié)果顯示，活性由強(qiáng)變?nèi)跻来螢椋阂一哙骸⒓谆哙?、嗎啉和哌啶。在?xì)胞毒性方面，這類化合物大多具有細(xì)胞毒性，但是其產(chǎn)生細(xì)胞毒性的濃度遠(yuǎn)高于其發(fā)揮抗瘧作用的濃度，因此可能可以被用來(lái)進(jìn)行抗瘧疾治療。

圖6 喹啉嘧啶類化合物結(jié)構(gòu)Fig.6 The structure of quinoline pyrimidine compounds

4 噻吩并嘧啶類化合物

Gonzalez等[27]經(jīng)過(guò)高通量篩選得到43種噻吩并嘧啶類化合物(圖7)。化合物15為其基本結(jié)構(gòu)。經(jīng)構(gòu)效關(guān)系的研究得出：1)R2上的苯基是必要的；2)R上甲胺基變成異丙胺基之后，活性降低?；衔?6為該項(xiàng)研究的起始物，具有一定的抗瘧活性(IC50=73 nmol/L)，且選擇性、溶解性都較好。對(duì)化合物16進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，得到一系列具有高抗瘧活性(IC50<20 nmol/L)的化合物(如化合物17～21)。在苯環(huán)上引入氰基得到化合物17和18。研究發(fā)現(xiàn)：這2個(gè)化合物具有更好的活性(IC50分別為17和19 nmol/L)，且選擇性、溶解性沒(méi)有太大影響。此外，化合物16、19和20可以抑制拜耳氏小鼠模型的瘧原蟲活性，并且當(dāng)以4組50 mg/kg劑量口服給藥時(shí)，小鼠平均生存時(shí)間顯著提高。而喹啉并嘧啶類化合物在相應(yīng)的劑量下未觀察到抗瘧效應(yīng)[26]?？傮w來(lái)看：藥物動(dòng)力學(xué)研究顯示化合物16具有高分布量、靜脈給藥后中度的血液清除度和適度的生物利用度。

5 總結(jié)

含嘧啶骨架的雜環(huán)類化合物為抗瘧藥的研發(fā)提供了新思路，其反應(yīng)活性較好，易于合成及改造，且具有多種藥理活性。在抗瘧機(jī)制方面，嘧啶類化合物以二氫葉酸還原酶或組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶為靶點(diǎn)，發(fā)揮著多種機(jī)制的抗瘧活性?；诖?，可與其他抗瘧機(jī)制的化合物(如，喹啉等)進(jìn)行合并、改造，實(shí)現(xiàn)抗瘧活性的最大化，并克服耐藥性的產(chǎn)生。此外，高通量篩選技術(shù)對(duì)藥物化學(xué)中先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)也至關(guān)重要，新型抗瘧藥物的發(fā)現(xiàn)還有賴于該技術(shù)的不斷發(fā)展和完善。

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