控氧發(fā)酵對(duì)干酪乳桿菌合成苯乳酸的影響

韓朝飛，關(guān)今韜,2，富敏霞，張頌紅，祝鈴鈺，贠軍賢

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院 綠色化學(xué)合成技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 杭州 310014；2.浙江大學(xué) 化學(xué)工程與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310027)

苯乳酸(phenyl lactic acid，PLA)是一種新型天然抑菌有機(jī)酸，具有廣譜抑菌能力和體外抗血小板聚集活性[1-2]，也可以作為合成聚苯乳酸新型材料的重要單體[3]，因此，在食品、醫(yī)藥和化工等行業(yè)中有廣闊的應(yīng)用前景。苯乳酸可以通過化學(xué)法和生物法進(jìn)行合成，其中，化學(xué)法合成路線長(zhǎng)、步驟復(fù)雜、需要使用毒性較大的溶劑。生物合成法相比化學(xué)法，具有操作過程安全簡(jiǎn)易、反應(yīng)條件溫和、成本低及可實(shí)現(xiàn)安全快速合成制備等優(yōu)點(diǎn)，因此，成為近幾年苯乳酸合成的研究重點(diǎn)[4-16]。

苯乳酸可由白地霉、丙酸桿菌、乳酸菌、芽孢桿菌、米根霉菌、光合細(xì)菌及熒光威克酵母菌等多種微生物代謝分泌產(chǎn)生[4]。Lavermicocca等[1]利用植物乳桿菌(Bacillusplantarum21B)合成苯乳酸，發(fā)酵液中苯乳酸的濃度達(dá)到56.44 mg/L。通過對(duì)菌體進(jìn)行一定的通透化處理，添加轉(zhuǎn)化合成底物，優(yōu)化pH、溫度及轉(zhuǎn)速等影響因素，可使苯乳酸的產(chǎn)量大幅度提升[2,6-7,13-14]。利用基因工程方法，通過引入外源基因?qū)N進(jìn)行基因改造，可使工程菌產(chǎn)量進(jìn)一步提高[5,8]。Zheng等[5]通過對(duì)大腸桿菌進(jìn)行基因改造，將來自凝結(jié)芽孢桿菌BacilluscoagulansNL01具有轉(zhuǎn)化苯丙酮酸(PPA)產(chǎn)L-PLA的乳酸脫氫酶基因和甲酸脫氫酶基因在大腸桿菌中異源共表達(dá)，進(jìn)行苯乳酸的合成，得到苯乳酸的濃度達(dá)79.6 mmol/L；Fujita等[3]將熒光威克酵母PPA還原酶在大腸桿菌中表達(dá)，所得工程菌發(fā)酵合成D-苯乳酸的質(zhì)量濃度達(dá)29 g/L。但是，基因工程菌直接在食品或醫(yī)藥等工業(yè)中應(yīng)用，尚有一定的限制。

以生物安全性優(yōu)良的食品微生物進(jìn)行苯乳酸微生物發(fā)酵或轉(zhuǎn)化合成，是苯乳酸合成的重要發(fā)展方向之一。筆者所在課題組利用干酪乳桿菌L.caseiB3，以苯丙酮酸為底物，進(jìn)行苯乳酸的轉(zhuǎn)化合成，轉(zhuǎn)化液中苯乳酸的質(zhì)量濃度達(dá)5.3 g/L[6]。溶氧是影響微生物發(fā)酵的重要因素，不同控氧條件下，微生物的生長(zhǎng)、代謝機(jī)制、酶系及分泌產(chǎn)物均會(huì)有較大差異。本文中，筆者通過實(shí)驗(yàn)方法，探索控氧條件對(duì)L.caseiB3菌發(fā)酵合成及轉(zhuǎn)化合成苯乳酸的影響規(guī)律，以期為研究利用干酪乳桿菌合成苯乳酸的新途徑打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

干酪乳桿菌L.caseiB3菌株保藏在浙江工業(yè)大學(xué)綠色化學(xué)合成技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地。

1.1.2 培養(yǎng)基

肉湯液體(MRS)培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，檸檬酸氫二胺2 g/L，無水乙酸鈉 5 g/L，MnSO40.25 g/L，MgSO40.58 g/L，K2HPO42 g/L，酵母膏5 g/L，牛肉膏10 g/L，吐溫-80 1 mL/L。

固體培養(yǎng)基是在MRS液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別添加20 g/L的瓊脂和30 g/L的CaCO3制得的。

1.1.3 主要試劑及儀器

苯乳酸、苯丙酮酸(分析純)，Sigma公司；其他試劑均為市售國(guó)產(chǎn)分析純。

BIOTECH-10BGZ型發(fā)酵罐，上海保興生物設(shè)備工程有限公司；Agilent 1260 Infinity高效液相色譜(HPLC)系統(tǒng)，美國(guó)安捷倫公司；HZ-2411KB型恒溫培養(yǎng)箱，太倉(cāng)市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；CR21N型高速冷凍離心機(jī)，日本日立公司；Ultrospec 3300 Pro型紫外/可見光分光光度計(jì)，美國(guó)GE Healthcare公司；Mini-PROTEAN Tetra型蛋白電泳儀，美國(guó)伯樂公司。

1.2 發(fā)酵與轉(zhuǎn)化

1.2.1 發(fā)酵

通過控制發(fā)酵罐中無菌空氣流量和攪拌轉(zhuǎn)速，分別于靜置、攪拌及通氣攪拌等條件下進(jìn)行發(fā)酵。其中，攪拌時(shí)的轉(zhuǎn)速均為100 r/min，通氣時(shí)，無菌空氣的流量維持在2 L/min。

配制MRS培養(yǎng)基5 L，3 L倒入10 L全自動(dòng)發(fā)酵罐，另外2 L使用2個(gè)1 L錐形瓶置于高壓滅菌鍋，121 ℃滅菌15～20 min。培養(yǎng)基冷卻至30 ℃，接種2%(體積分?jǐn)?shù))種子液，培養(yǎng)72 h。分別于4、8、12、16、20、24、28、32、36、48、60和72 h取樣30 mL，將發(fā)酵液離心(8 000 r/min、15 min)，稱量離心所得菌體的質(zhì)量(濕質(zhì)量)，計(jì)算菌體含量；離心所得上清液用于檢測(cè)，得到其中的苯乳酸及葡萄糖含量。

1.2.2 轉(zhuǎn)化

分別取0.5 g通過靜置、攪拌及通氣攪拌等條件下培養(yǎng)得到的濕菌體，作為全細(xì)胞催化劑，以苯丙酮酸為底物，進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，合成苯乳酸。轉(zhuǎn)化溫度35 ℃，轉(zhuǎn)速75 r/min下反應(yīng)4 h，轉(zhuǎn)化液經(jīng)離心分離，取上清液進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 葡萄糖的檢測(cè)

采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法。取離心后發(fā)酵上清液1.5 mL，加入3 mL DNS試劑，在沸水中加熱5 min，迅速冷卻，取0.2 mL，加入2.5 mL超純水，混合均勻，放置10～15 min，在480 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵液中葡萄糖消耗變化情況。

1.3.2 苯乳酸的檢測(cè)

采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定。流動(dòng)相：A為水(0.05%三氟乙酸)，B為甲醇(0.05%三氟乙酸)。梯度洗脫步驟：0～20 min時(shí)，流動(dòng)相B從10%線性上升至 100%；在20～23 min 期間，流動(dòng)相B保持100%；最后在23～25 min時(shí)，流動(dòng)相B從100%線性降至10%。DAD二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，流動(dòng)相流速為1 mL/min，色譜柱的溫度為30 ℃。對(duì)發(fā)酵液或轉(zhuǎn)化液進(jìn)行離心處理，取上清液，用0.22 μm的針筒過濾器過濾，選擇適宜稀釋倍數(shù)稀釋，進(jìn)行檢測(cè)[6]。

1.3.3 SDS-PAGE凝膠電泳分析酶蛋白

SDS-PAGE法分析菌體胞內(nèi)酶。將菌體用生理鹽水洗滌2次，200 W超聲破碎20～30 min，離心取上清液作為樣品溶液，用凝膠電泳法進(jìn)行分析。分離膠濃度12%，運(yùn)行電壓為160 V，上樣量10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同控氧條件下L.casei B3的生長(zhǎng)曲線及葡萄糖消耗

對(duì)L.caseiB3進(jìn)行靜置發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)溫度30 ℃，培養(yǎng)時(shí)間72 h，測(cè)得發(fā)酵過程中菌體濃度的變化；維持相同溫度，在發(fā)酵罐中通過調(diào)控通氣流量和攪拌轉(zhuǎn)速，進(jìn)行控氧發(fā)酵，測(cè)得相應(yīng)菌體生物量隨發(fā)酵時(shí)間的變化，得到生長(zhǎng)曲線，如圖1所示。通過DNS法，對(duì)3種不同控氧條件下發(fā)酵過程中葡萄糖消耗情況進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖2所示。

由圖1和2可見：無論靜置、攪拌或者通氣攪拌條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，菌體的生長(zhǎng)曲線基本不變，葡萄糖的消耗與菌體生物量的累積曲線也基本一致。從發(fā)酵開始，菌體在4～24 h期間進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)葡萄糖迅速消耗，殘?zhí)菨舛认陆?，生物量隨時(shí)間迅速增長(zhǎng)，24 h后趨于穩(wěn)定，殘?zhí)琴|(zhì)量濃度已降至約1 g/L。在靜置、攪拌或者通氣攪拌條件下，發(fā)酵液中的濕菌體質(zhì)量濃度分別約17.7、18.7和18.9 g/L，這說明不同控氧條件對(duì)菌體生長(zhǎng)影響很小，各生長(zhǎng)階段菌體生長(zhǎng)變化程度不大，最終生物量基本不變。

圖1 不同控氧條件下L.casei B3菌生長(zhǎng)曲線Fig.1 Cell growth curves of L.casei B3 strain under different oxygen control conditions

圖2 不同控氧條件下L.casei B3發(fā)酵過程中葡萄糖的消耗Fig.2 Glucose consumption curves of L.casei B3 strain under different oxygen control conditions

2.2 不同控氧條件下L.casei B3發(fā)酵合成苯乳酸

用HPLC法對(duì)靜置、攪拌或者通氣攪拌條件下所得的發(fā)酵液中苯乳酸的濃度進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。由圖3可見：在靜置、攪拌和通氣攪拌條件下，L.caseiB3在發(fā)酵過程中產(chǎn)苯乳酸都隨發(fā)酵時(shí)間逐漸增加。在菌體生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，生物量累積迅速，苯乳酸濃度不斷增加；當(dāng)菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期，發(fā)酵液中的苯乳酸濃度不再增加。3種控氧條件下的規(guī)律是類似的。但是，不同控氧條件下發(fā)酵液中苯乳酸的最大濃度有所差異。靜置、攪拌和通氣攪拌控氧條件下發(fā)酵合成苯乳酸的質(zhì)量濃度分別達(dá)0.058、0.082和0.023 g/L，攪拌條件下發(fā)酵的結(jié)果比靜置條件下的提高了41.4%，而通氣攪拌條件下得到的苯乳酸濃度最低，比靜置發(fā)酵條件下降低了約60.3%，說明充足的供氧不利于苯乳酸的合成。

圖3 不同控氧條件下L.casei B3發(fā)酵過程中合成苯乳酸濃度的變化Fig.3 Variation of PLA concentration in L.casei B3 under different oxygen control conditions

2.3 不同控氧條件下L.casei B3轉(zhuǎn)化合成苯乳酸

筆者所在課題組的朱銀龍等[6]研究發(fā)現(xiàn)，以PPA為底物，利用L.caseiB3轉(zhuǎn)化合成苯乳酸的過程中，轉(zhuǎn)化液pH、溫度、轉(zhuǎn)速、葡萄糖濃度、轉(zhuǎn)化時(shí)間及底物濃度等都會(huì)對(duì)苯乳酸濃度和轉(zhuǎn)化率產(chǎn)生影響。其中，轉(zhuǎn)化液pH和底物濃度是關(guān)鍵因素。轉(zhuǎn)化液的pH為7～8時(shí)，底物濃度的變化對(duì)苯乳酸的轉(zhuǎn)化合成起決定性作用。因此，本實(shí)驗(yàn)中，筆者首先對(duì)不同底物濃度下L.caseiB3轉(zhuǎn)化合成苯乳酸的濃度和轉(zhuǎn)化率進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)測(cè)定。

將L.caseiB3在30 ℃培養(yǎng)72 h，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行離心，獲得濕菌體。在-20 ℃條件下對(duì)菌體進(jìn)行低溫冷凍透性化處理，分別于PPA質(zhì)量濃度4、6、8、10和12 g/L下進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)條件：葡萄糖14 g/L、菌體100 g/L、pH 8.0、溫度35 ℃、轉(zhuǎn)速75 r/min、轉(zhuǎn)化時(shí)間4 h?？疾觳煌孜颬PA濃度下，全細(xì)胞轉(zhuǎn)化得到的苯乳酸濃度及轉(zhuǎn)化率結(jié)果，如圖4所示。

由圖4可見：在底物苯丙酮酸8 g/L條件下，L.caseiB3轉(zhuǎn)化合成苯乳酸的質(zhì)量濃度達(dá)5.4 g/L，此時(shí)轉(zhuǎn)化率為67.2%，與課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[6]。本文結(jié)果進(jìn)一步說明，L.caseiB3菌體轉(zhuǎn)化合成苯乳酸性能穩(wěn)定，適宜底物質(zhì)量濃度為8 g/L。因?yàn)榈孜餄舛冗^高時(shí)，產(chǎn)物濃度會(huì)下降，對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)具有一定的抑制作用。

接著，分別以靜置、攪拌、通氣攪拌這3種不同控氧發(fā)酵條件下所得的菌體為全細(xì)胞催化劑，以質(zhì)量濃度8 g/L的PPA為底物，進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，其他轉(zhuǎn)化條件與上述實(shí)驗(yàn)相同。通過HPLC法對(duì)所得的轉(zhuǎn)化液進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5所示。

圖4 底物PPA濃度對(duì)L.casei B3轉(zhuǎn)化合成苯乳酸的濃度及轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 Effects of PPA concentration on concentration and yield of PLA transformed by L.casei B3

圖5 不同控氧條件下培養(yǎng)的L.casei B3轉(zhuǎn)化合成的苯乳酸HPLC檢測(cè)結(jié)果Fig.5 HPLC of PLA by transformation using L.casei B3 cells obtained from different oxygen control conditions

圖6 不同控氧條件下L.casei B3轉(zhuǎn)化合成苯乳酸的濃度及轉(zhuǎn)化率的比較Fig.6 Comparison of concentrations and yields of PLA transformed by L.casei B3 cells obtained from different oxygen control conditions

由圖5可見:以靜置、攪拌和通氣攪拌3種不同控氧發(fā)酵條件下所得的L.caseiB3菌體為全細(xì)胞催化劑，用于轉(zhuǎn)化合成苯乳酸，所得轉(zhuǎn)化液中都檢測(cè)到了苯乳酸產(chǎn)物。

考察3種不同控氧發(fā)酵條件下所得菌體轉(zhuǎn)化PPA合成PPL的能力，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知：在靜置與攪拌條件下,菌體轉(zhuǎn)化合成的苯乳酸質(zhì)量濃度及轉(zhuǎn)化率基本接近，分別為5.4 g/L、67.2%和5.1 g/L、62.7%；但是，通氣攪拌條件下的菌體轉(zhuǎn)化生成苯乳酸含量和轉(zhuǎn)化率明顯降低，轉(zhuǎn)化率為35.9%，苯乳酸的質(zhì)量濃度僅為2.9 g/L，比靜置條件下降低了46.3%。生物酶是影響發(fā)酵過程中代謝分泌物的重要因素，不同的控氧條件對(duì)生物酶活性有著重要的影響[17-18]。

將不同控氧發(fā)酵條件下L.caseiB3菌體進(jìn)行破胞，用SDS-PAGE電泳對(duì)破胞液中的蛋白質(zhì)進(jìn)行了分析，結(jié)果見圖7。

圖7 不同控氧條件下L.casei B3破胞液SDS-PAGE電泳分析Fig.7 SDS-PAGE analysis of L.casei B3 cell disrupted solution under different oxygen control conditions

由圖7可見：L.caseiB3菌體中含有眾多不同分子量的蛋白質(zhì)，其分子量分布很寬，范圍為1.0×104～1.4×105；不同控氧發(fā)酵條件下菌體胞內(nèi)蛋白分布存在較大差異。在上述轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，乳酸脫氫酶、苯丙酮酸還原酶等相關(guān)生物酶起至關(guān)重要的作用，尤其是乳酸脫氫酶是轉(zhuǎn)化PPA合成PLA的關(guān)鍵酶[19]。因此，不同控氧發(fā)酵條件下，L.caseiB3菌代謝機(jī)制或副產(chǎn)物的生成各不相同，尤其是通氣條件下造成轉(zhuǎn)化液中苯乳酸含量銳減，其原因可能是轉(zhuǎn)化生成PLA的相關(guān)生物酶含量及活性下降(分子量為4.0×104左右的酶)，進(jìn)而導(dǎo)致苯乳酸濃度下降。

3 結(jié)論

控氧發(fā)酵對(duì)L.caseiB3產(chǎn)苯乳酸和轉(zhuǎn)化合成苯乳酸具有重要影響，但對(duì)菌體生長(zhǎng)影響不大。在靜置、攪拌和通氣攪拌等不同控氧條件下，L.caseiB3菌體發(fā)酵合成苯乳酸的濃度不同，適當(dāng)?shù)臄嚢栌欣诎l(fā)酵合成苯乳酸，但充足供氧的通氣攪拌不利于苯乳酸的發(fā)酵合成。在轉(zhuǎn)速100 r/min的攪拌條件下，L.caseiB3菌體發(fā)酵合成苯乳酸的濃度比靜置發(fā)酵條件下提高了41.4%；但在空氣流量2 L/min及轉(zhuǎn)速100 r/min的通氣攪拌下，發(fā)酵合成苯乳酸的濃度較靜置發(fā)酵時(shí)下降了60.3%。

以L.caseiB3菌體為全細(xì)胞催化劑，以苯丙酮酸為主要底物，經(jīng)生物轉(zhuǎn)化合成苯乳酸時(shí)，底物濃度過高會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化合成苯乳酸的濃度下降，對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)有一定的抑制作用。以相應(yīng)靜置、攪拌及通氣攪拌所得L.caseiB3菌體為全細(xì)胞催化劑，在PPA 8 g/L、葡萄糖14 g/L、菌體質(zhì)量濃度100 g/L、pH 8.0、溫度35 ℃、轉(zhuǎn)速75 r/min和轉(zhuǎn)化時(shí)間4 h條件下，轉(zhuǎn)化合成苯乳酸時(shí)，轉(zhuǎn)化合成苯乳酸的摩爾轉(zhuǎn)化率分別為67.2%、62.7%和35.9%，說明充足的供氧不利于苯乳酸的轉(zhuǎn)化合成，這可能與L.caseiB3菌體中的乳酸脫氫酶、苯丙酮酸還原酶等關(guān)鍵生物酶有密切關(guān)系。

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