蘇州活禽市場(chǎng)禽流感病毒(H7N9)季節(jié)變化及HA、NA、PB2基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

朱杰，張琰，張超，唐盺瑩，張洪波，王祥，宋宇峰，周東明，王慶林

1. 湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410013； 2. 中國(guó)科學(xué)院上海巴斯德研究所疫苗中心，上海 200031

隨著新型禽流感病毒H7N9感染病例的相繼報(bào)道，自2013年初至2017年6月，其已在中國(guó)經(jīng)歷了5個(gè)流行周期，造成 1 552 例人感染H7N9病例，病死率約40%[1]。2016年12月在廣東省首次發(fā)現(xiàn)高致病性H7N9病毒，其母源病毒來(lái)自2015年的長(zhǎng)江三角洲流行地區(qū)，但母源病毒呈低致病性[2]。2017年初在湖南省和廣西壯族自治區(qū)等地區(qū)也發(fā)現(xiàn)高致病性H7N9病毒[3]。禽流感病毒H7N9由于致病性低，僅引起禽類的無(wú)癥狀感染，此前很少受到關(guān)注。但新型H7N9病毒能引起人類發(fā)生高熱、肺炎和其他呼吸道癥狀及多器官功能衰竭等嚴(yán)重疾病被報(bào)道后，人們對(duì)其的關(guān)注度日益提高[4-6]。

中國(guó)人日常生活中活禽市場(chǎng)普遍存在。但活禽市場(chǎng)對(duì)家禽來(lái)源的監(jiān)管力度不夠，特別是個(gè)體農(nóng)戶自由放養(yǎng)的家禽很容易被野禽攜帶的禽流感病毒感染。有報(bào)道稱，在大多數(shù)流行地區(qū)，人通過(guò)與活禽市場(chǎng)接觸而被感染，意味著活禽市場(chǎng)與人類之間存在流行病學(xué)聯(lián)系[7]?；钋菔袌?chǎng)中家禽來(lái)源的復(fù)雜性有利于不同亞型禽流感病毒在不同品種家禽之間相互傳播[8-11]。新型H7N9病毒的HA基因與來(lái)自鴨的H7N3病毒有關(guān)，NA基因與來(lái)自野生候鳥的H2N9和H11N9病毒有關(guān)，其他基因可能來(lái)自H9N2病毒[12-14]。

蘇州位于中國(guó)江蘇省南部，是一個(gè)重要的經(jīng)濟(jì)交通中心。西面為中國(guó)五大淡水湖之一的太湖,且與浙江省和上海市毗鄰，而后兩地是2013年H7N9病毒流行的主要受影響地區(qū)。太湖的天然濕地是東亞-澳大利亞候鳥遷徙路線中的歇息地，有許多野生鳥類。這種新型H7N9病毒在太湖周圍其他城市的活禽市場(chǎng)中也被發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，如湖州[15]和嘉興[16]，但其在蘇州的流行病學(xué)尚不清楚。本研究于2013年7—12月在H7N9病毒主要流行地區(qū)之一江蘇省蘇州市活禽市場(chǎng)采集2 655份雞、鴨咽拭子樣本，對(duì)樣本中的流感病毒進(jìn)行核酸檢測(cè)，并進(jìn)一步對(duì)H7N9陽(yáng)性樣本中的HA、NA和PB2基因進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化分析來(lái)追蹤新型H7N9病毒的進(jìn)化史。

1 材料與方法

1.1 咽拭子收集

2013年7—12月，于蘇州活禽市場(chǎng)隨機(jī)收集雞、鴨咽拭子，共計(jì) 2 655 份樣本。樣本保存于 2～3 mL含100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的 Hank’s 液中，于-70 ℃凍存。

1.2 病毒擴(kuò)增

選擇發(fā)育良好的9～11日齡無(wú)特定病原體(specific pathogen free，SPF)雞胚，常規(guī)無(wú)菌處理咽拭子樣本。取適量樣本溶液，用無(wú)菌環(huán)接種于雞胚尿囊腔，放入37 ℃孵育箱培養(yǎng)。接種后24 h內(nèi)將死亡的雞胚舍棄；24 h后，每天照蛋2次，如發(fā)現(xiàn)雞胚死亡，立即放入冰箱暫存；孵育36～48 h后，收取尿囊液。將完成病毒擴(kuò)增的尿囊液凍存于-70 ℃。上述所有操作均在生物安全三級(jí)(biosafety level 3，BSL-3)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。

1.3 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)

按RNA提取操作步驟, 用TRIzol試劑(Invitrogen公司)提取尿囊液中的病毒RNA[17]。取適量尿囊液置于RNase-free EP管中，加入TRIzol試劑劇烈振蕩后，室溫靜置；加入氯仿(氯仿體積為TRIzol試劑的1/5)，劇烈振蕩后室溫靜置；將RNase-free EP管放入 4 ℃ 預(yù)冷的離心機(jī)中，12 000 r/min于4 ℃離心 20 min；用無(wú)菌槍頭(Thermo Scientific公司)取上層液體置于另一新的RNase-free EP管中，加入異丙醇，上下顛倒混勻，室溫靜置或-80 ℃靜置；將RNase-free EP管離心，棄上清液，每管加入適量75%乙醇洗滌RNA沉淀，然后離心；棄上清液，室溫靜置晾干；將純化后的RNA溶解于10 μL DEPC水(中國(guó)大連TaKaRa公司)。使用通用引物Uni12將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)參數(shù)：去DNA體系 42 ℃ 3 min，16 ℃暫存；反轉(zhuǎn)錄體系 42 ℃ 15 min，95 ℃ 3 min，16 ℃暫存。將得到的cDNA存于 -80 ℃。以cDNA為模板，使用3對(duì)特殊引物擴(kuò)增H5、H7和H9亞型基因片段，以檢測(cè)這些樣本中禽流感病毒的混合感染。本研究所使用引物詳見表1。

表1PCR和測(cè)序引物

Tab.1PCRandsequencingprimersusedinthisstudy

Primers Sequences (5'-3')H5-155f5'-ACACATGCYCARGACATACT-3'H5-699r5'-CTYTGRTTYAGTGTTGATGT-3'H9-151f5'-CTYCACACAGARCACAATGG-3'H9-638r5'-GTCACACTTGTTGTTGTRTC-3'NA9-975f5'-TGTAATGACCCTTATCCAGG-3'NA9-1382r5'-GTTCCATTGTCCAAGGAATTC-3'H7-12f5'-GGGATACAAAATGAAYACTC-3'H7-645r5'-CCATABARYYTRGTCTGYTC-3'Bm-PB2-15'-TATTGGTCTCAGGGAGCGAAAGCAG- GTC-3'PB2-1250R5'-TCYTCYTGTGARAAYACCAT-3'RV-M5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'M13-475'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'Uni125'-AGCAAAAGCAGG-3'

1.4 測(cè)序和禽流感病毒的系統(tǒng)進(jìn)化分析

將擴(kuò)增的HA、NA和PB2基因片段克隆至pMD18-T載體(中國(guó)大連TaKaRa公司)，采用RV-M和M13-47引物，ABI 3730XL遺傳分析儀(ABI公司)的Sanger雙脫氧測(cè)序法進(jìn)行測(cè)序。將獲得的HA、NA和PB2核酸序列提交至全球共享禽流感倡議組織(Global Initiative on Sharing All Influenza Data，GISAID)-EpiFlu數(shù)據(jù)庫(kù)，基因序列號(hào)為EPI_ISL_205835～EPI_ISL_205849。對(duì)收集到的樣本序列進(jìn)行多線程擴(kuò)增，用ClustalW軟件將GenBank和GISAID數(shù)據(jù)庫(kù)作為數(shù)據(jù)源分析收集到的序列數(shù)據(jù)。采用鄰接法(neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，在Kimura 2核酸替代模型中重復(fù)抽樣1 000次對(duì)進(jìn)化樹進(jìn)行驗(yàn)證。成對(duì)的核苷酸同源性計(jì)算中包括所有3個(gè)密碼子的位置和成對(duì)丟失的情況，所有計(jì)算采用Mega 6.06軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 樣本陽(yáng)性率檢測(cè)

本研究共采集 2 655 份咽拭子樣本(雞 2 155 份，鴨 500份)，采用RT-PCR檢測(cè)H5、H7和H9亞型的病毒基因。結(jié)果顯示，H5、H7和H9亞型的陽(yáng)性率分別為 0.87%(23/2 655)、1.62%(43/2 655)和 2.82%(75/2 655)(表 2)。7—9月樣本中各病毒陽(yáng)性檢出率較低，而10—12月樣本中各病毒陽(yáng)性檢出率呈逐漸上升趨勢(shì)。根據(jù)蘇州的天氣記錄，2013年7—12月的月平均氣溫分別為 36.32 ℃、35.10 ℃、28.23 ℃、23.03 ℃、17.60 ℃ 和 10.42 ℃(http://www.accuweather.com/)，月平均溫度的變化與H5(r=-0.906，P=0.013)、H7(r=-0.837，P=0.038)和H9(r=-0.869，P=0.024)亞型陽(yáng)性檢出率呈負(fù)相關(guān)，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述結(jié)果提示，氣溫>25 ℃時(shí)，禽流感病毒在家禽中的暴發(fā)相對(duì)減少，大致推斷家禽對(duì)流感病毒的易感溫度范圍為12～15 ℃[18-19]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)了禽流感病毒H5、H7和H9亞型之間的混合感染：H7和H9為 0.94%(25/2 655)，H5和H7為 0.08%(2/2 655)，H5和H9為 0.26%(7/2 655)，H5、H7和H9為 0.30%(8/2 655)。H7和H9亞型之間重組概率最高?；旌细腥究赡墚a(chǎn)生引起人類流感大流行的強(qiáng)毒株。

表2咽拭子中的禽流感病毒

Tab.2Theprevalenceofavianinfluenzavirusesinswabsamples

Monthn(%)H5H7H9Swab samplesJul. 20130(0)0(0)7(1.17)600Aug. 20130(0)5(0.89)11(1.96)560Sept. 20131(0.25)5(1.25)11(2.75)400Oct. 20132(0.34)10(1.72)8(1.38)580Nov. 20137(2.80)4(1.60)17(6.80)250Dec. 201313(4.91)19(7.17)21(7.92)265Total23(0.87)43(1.62)75(2.82)2 655

2.2 基因序列分析

針對(duì)得到的核酸序列，在基于HA和NA核酸序列基礎(chǔ)上進(jìn)行亞型和系統(tǒng)進(jìn)化分析。

如圖1所示，HA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析主要基于H5、H7和H9亞型。結(jié)果顯示，從蘇州活禽市場(chǎng)中分離獲得的病毒與從感染新型H7N9病毒的臨床患者中分離獲得的病毒(A/Anhui/1/2013株和A/Huzhou/3/2013株等)高度同源，這些毒株之間HA基因序列同源性最高為 98.7%，提示H7N9病毒存在人類與禽類之間傳播的風(fēng)險(xiǎn)。

The dendrogram was constructed by using the neighbor-joining method based on the alignment of the partial sequences of the HA region of Suzhou influenza strains and other reference strains downloaded from GenBank or GISAID. Bootstrap values (%) for 1 000 replicates were calculated, and only values >80% are shown at the nodes. Red dots indicate Suzhou isolates in this study, and green triangles indicate the clinical isolates from patients.

圖1流感病毒HA核苷酸序列進(jìn)化樹

Fig.1PhylogeneticdendrogrambasedonHAnucleotidesequencesoftheinfluenzaviruses

NA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析主要基于N9和N2兩個(gè)亞型(圖2)。結(jié)果顯示，從蘇州活禽市場(chǎng)中分離獲得的病毒與從長(zhǎng)江三角洲區(qū)域患者和禽類中分離獲得的新型H7N9病毒也高度同源，NA基因序列的相似率最高達(dá) 96.4%。禽類樣本與臨床患者樣本之間的密切聯(lián)系進(jìn)一步明確了可能存在從家禽到人類的傳播鏈。值得注意的是， 2013年從上海第1例感染H7N9病毒的患者中分離得到的病毒，在HA和NA進(jìn)化樹中同樣位于新型H7N9病毒分支中的基底分支，提示2013年1月從上海患者體內(nèi)分離到的禽流感病毒與蘇州活禽市場(chǎng)樣本中的禽流感病毒有同源性。

The dendrogram was constructed by using the neighbor-joining method based on the alignment of the partial sequences of the NA region of Suzhou influenza strains and other reference strains downloaded from GenBank or GISAID. Bootstrap values (%) for 1 000 replicates were calculated, and only values >80% are shown at the nodes. Red dots indicate Suzhou isolates in this study, and green triangles indicate the clinical isolates from patients.

圖2流感病毒NA核苷酸序列進(jìn)化樹

Fig.2PhylogeneticdendrogrambasedonNAnucleotidesequencesoftheinfluenzaviruses

根據(jù)PB2基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹可分為4個(gè)分支(圖 3)。分支Ⅰ：主要為2013年分離到的H7N9病毒；分支Ⅱ：主要為2013年分離到的H9N2病毒；分支Ⅲ：主要包含2013年和2014年分離到的H9N2病毒和H7N9病毒；分支Ⅳ：主要為H5N1病毒。從蘇州活禽市場(chǎng)樣本中分離獲得的病毒中，分支Ⅲ有8種，分支Ⅱ有3種。結(jié)果表明，蘇州活禽市場(chǎng)樣本中的病毒可能源于與H9N2亞型的基因重排。分支Ⅳ中，A/Chicken/Suzhou/12-8/2013株與H5N1毒株相似，表明禽類中也出現(xiàn)了與H5N1的基因重排。此外，H9N2兩個(gè)參考株(EPI145385 和 EPI145390)作為分支Ⅲ的基礎(chǔ)分支，其基因序列比同分支中其他H9N2株更接近A/Chicken/Suzhou/11-26/2013株。結(jié)果表明，H7N9和H9N2的PB2基因可能為相同來(lái)源，提示H7N9的PB2基因可能源于早期的H9N2毒株。

The dendrogram was constructed by using the neighbor-joining method based on the alignment of the partial sequences of the PB2 region of Suzhou influenza strains and other reference strains downloaded from GenBank or GISAID. Bootstrap values (%) for 1 000 replicates were calculated, and only values >80% are shown at the nodes. Red dots indicate Suzhou isolates in this study, and green triangles indicate the clinical isolates from patients.

圖3流感病毒PB2核苷酸序列進(jìn)化樹

Fig.3PhylogeneticdendrogrambasedonPB2nucleotidesequencesoftheinfluenzaviruses

3 討論

有研究表明，H9N2禽流感病毒在新型H7N9病毒的基因重排中起重要作用[20-22]，而H5亞型與H9N2在進(jìn)化方面密切相關(guān)[23]。通過(guò)PCR檢測(cè) 2 655 份咽拭子樣本中的H5、H7和H9亞型，確認(rèn)蘇州活禽市場(chǎng)中3種HA亞型的流行情況，同時(shí)探討家禽在H7N9及相關(guān)病毒持續(xù)基因重排傳代中的作用。結(jié)果顯示，所有樣本中H7(1.62%)和H9(2.82%)的陽(yáng)性率高于H5(0.87%)，表明H7與H9亞型之間更有機(jī)會(huì)發(fā)生重排。盡管HA的3種亞型存在混合感染，但H7N9與H9N2混合感染出現(xiàn)的頻率最高。此外，所有混合感染僅存在于雞樣本中，意味著雞體內(nèi)更適合多種禽流感病毒的共存，新型病毒更容易在活禽市場(chǎng)產(chǎn)生[24]。樣本陽(yáng)性率隨時(shí)間變化顯現(xiàn)：從7月到9月逐漸降低，10月到12月逐漸增高。季節(jié)性溫度變化影響家禽間禽流感病毒的傳播，低溫和相對(duì)高濕度有利于病毒傳播[25-26]，這可能是2013年至2014年冬季中國(guó)若干省份出現(xiàn)H7N9第二波暴發(fā)及迅速傳播的原因。

HA和NA基因片段的進(jìn)化樹分析顯示，從蘇州活禽市場(chǎng)中分離獲得的H7N9病毒與從周邊城市上海、湖州分離獲得的H7N9毒株非常接近，意味著長(zhǎng)江三角洲區(qū)域傳播的新型H7N9病毒可能有共同起源。此外，PB2基因片段的系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，新出現(xiàn)的H7N9病毒PB2基因在H9N2和H5N1中也存在，提示PB2基因片段可能是這3種病毒基因重排的結(jié)果。本研究獲得的病毒中有3株接近臨床患者A/Shanghai/1/2013株，A/chicken/Suzhou/12-8/2013株接近H5N1亞型，其他接近H9N2亞型。A/chicken/Suzhou/12-8/2013株接近H5N1毒株提示其他類型的基因多重重排有可能正在進(jìn)行。新型H7N9病毒的PB2基因在哺乳動(dòng)物感染流感病毒中起重要作用[27]。鑒于PB2基因的多重重排很可能產(chǎn)生能感染人類的新型禽流感病毒，蘇州活禽市場(chǎng)需持續(xù)監(jiān)控。

蘇州位于中國(guó)江蘇省南部，屬于長(zhǎng)江三角洲區(qū)域，擁有高密度的活禽市場(chǎng)和人口。在太湖，禽流感病毒在不同物種之間的共感染是病毒亞型多樣化的重要條件，這也可能是與之毗鄰的蘇州更容易遭受禽流感病毒攻擊的原因之一[28]。2013年4月蘇州確診的H7N9病毒感染事件有2例，2014年有4例，且被感染者均有近期接觸家禽的經(jīng)歷。遺憾的是，本研究缺乏確診案例中H7N9病毒的序列，無(wú)法闡明活禽市場(chǎng)所獲病毒與2014年H7N9感染病例之間的關(guān)系。但值得注意的是，蘇州可能是H7N9病毒的傳播來(lái)源之一。2013年4月和2015年1月，蘇州市政府關(guān)閉活禽市場(chǎng)以控制H7N9病毒的流行，同時(shí)還禁止一些小規(guī)模農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)中的個(gè)體農(nóng)戶出售活禽。這些措施是有效的，因?yàn)?015年僅零星出現(xiàn)了人感染病例。但長(zhǎng)期關(guān)閉活禽市場(chǎng)不現(xiàn)實(shí)，考慮到之前提出的禽流感病毒的季節(jié)性變化，因此對(duì)活禽市場(chǎng)的監(jiān)測(cè)應(yīng)主要放在冬季。禽流感病毒在家禽中的高流行率、遺傳多樣性和廣泛的宿主范圍意味著其能持續(xù)通過(guò)重排形成新病毒，并可能引起再次流行。因此，受影響地區(qū)急需對(duì)家禽中所有禽流感病毒亞型進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測(cè)，用整個(gè)8序列片段來(lái)檢測(cè)基因重排病毒也值得考慮。在中國(guó)，改善家禽飼養(yǎng)方式及監(jiān)控家禽供應(yīng)鏈中的每一個(gè)環(huán)節(jié)均對(duì)流感防控至關(guān)重要。

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