頭花蓼內(nèi)生真菌Aspergillus terreus油脂類代謝物的鑒定及其抗多藥耐藥菌和抗炎作用研究Δ

劉俊，張青艷，楊馨，周孟，廖尚高，徐國波，#（.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴陽55005；.國家苗藥工程技術(shù)中心及民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴陽 550004；3.湖南華容縣人民醫(yī)院藥劑科，湖南華容 4400）

頭花蓼（Polygonum capitatumBuch.-Ham.ex D.Don）為蓼科蓼屬植物頭花蓼的干燥全草，是貴州省道地藥材，臨床上主要用于治療泌尿系統(tǒng)感染疾病[1]。泌尿系統(tǒng)感染是臨床上僅次于呼吸道感染的常見感染性疾病之一[2]，主要致病菌為大腸埃希菌，其次為變形桿菌和克雷伯桿菌[3]。目前，泌尿系統(tǒng)感染的一線治療方法仍然為抗生素治療。然而隨著抗生素的不當(dāng)使用，我國因抗生素濫用導(dǎo)致的耐藥問題尤為突出[4]。尋找新型可抑制因病原菌感染而產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)的藥物對治療泌尿系統(tǒng)感染疾病具有重要意義。

植物內(nèi)生菌因可產(chǎn)生與宿主代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)密切相關(guān)或具有特殊功效的代謝產(chǎn)物，已成為藥物開發(fā)的重要資源[5]。目前，有關(guān)貴州道地藥材頭花蓼內(nèi)生真菌的相關(guān)研究鮮見報道。經(jīng)前期頭花蓼內(nèi)生菌的分離及代謝物抗菌活性篩選研究，發(fā)現(xiàn)菌株Aspergillus terreus的代謝產(chǎn)物對泌尿系統(tǒng)感染多重耐藥菌具有抑制作用，對大腸埃希菌的抗多藥耐藥菌作用明顯高于頭花蓼提取物，且其油脂類代謝物占據(jù)其總代謝物的60%以上。故本研究對頭花蓼內(nèi)生真菌A.erreus油脂類代謝物的化學(xué)成分進行鑒定，并對其抗多藥耐藥菌和抗炎作用進行評估，旨在為開發(fā)頭花蓼內(nèi)生真菌資源及獲得抗泌尿系統(tǒng)感染的化學(xué)成分奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

HP6890/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）儀（美國Agilent公司）；ELX808全自動酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司）。

1.2 藥品與試劑

頭孢曲松鈉醫(yī)用原料藥（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，批號：161115，純度：92%）；頭花蓼水提醇沉物（AEPC，藥材全草來源于貴州貴陽，批號：1705035，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)生藥學(xué)教研室龍慶德教授鑒定為真品）；棕櫚酸（批號：C10071559，純度：99%）、亞油酸（批號：C10088568，純度：≥99%）、油酸（批號：C10095822，純度：95%）、硬脂酸（批號：C10078692，純度：98%）對照品均購自上海麥克林公司；DNA提取試劑盒（美國Omega公司，批號：D3390-01）；MTS[普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司，批號：M2117]；腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）測定試劑盒（美國Ray Biotech公司，批號：041417081）；胎牛血清（美國Hyclone公司，批號：NZE2489）；脂多糖（LPS，美國 Sigma公司，批號：117M4855V）；地塞米松原料藥（湖北遠成賽創(chuàng)科技有限公司，批號：17090721B，純度：99%）。

1.3 菌種與細(xì)胞

內(nèi)生真菌菌株是從貴陽市采集的頭花蓼的根莖韌皮部分離得到，經(jīng)rDNA的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS序列）進行分子鑒定，根據(jù)ITS序列相似性鑒定為A.terreus（ITS序列相似性為99%）；10株多藥耐藥菌株（肺炎克

雷伯桿菌、普通變形桿菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌、奇異變形桿菌、屎腸球菌和鮑曼不動桿菌）為貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科饋贈，均為臨床分離的多重耐藥菌株；小鼠單核巨噬細(xì)胞株（RAW264.7細(xì)胞）購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

2 方法與結(jié)果

2.1 發(fā)酵

參考文獻[6]方法。一級種子發(fā)酵：在無菌室中將斜面上的A.terreus菌種接種到已滅菌的液體培養(yǎng)基中，于恒溫箱中培養(yǎng)3 d。二級發(fā)酵：將一級種子按12%的接種量均勻地接種到已滅菌的固體培養(yǎng)基上，并將培養(yǎng)基放在培養(yǎng)箱中26～28℃恒溫培養(yǎng)29 d。

2.2 油脂類代謝物的獲得

取A.terreus固態(tài)發(fā)酵物3 kg，在50℃下用乙酸乙酯浸提2次，每次2 d，減壓濃縮得浸膏8.0 g。浸膏經(jīng)硅膠柱層析（180 g，400 mm×40 mm，石油醚洗脫）得到油脂類代謝物5.04 g，占總浸膏量的63%。

2.3 油脂類代謝物的成分鑒定

2.3.1 供試品溶液的制備 脂肪酸氣化溫度會超過色譜柱耐受溫度，高溫下不穩(wěn)定、易裂解，分析中易造成損失，因此對脂肪酸組分分析時，先將脂肪酸甲酯化。稱取油脂類代謝物0.1 g，置于50 mL錐形瓶中，加入0.5mol/L氫氧化鉀甲醇溶液2 mL，65℃回流30 min，放冷；加入三氟化硼甲醇溶液2 mL，65℃加熱回流30 min，放冷；加入庚烷4 mL，65℃加熱回流5 min，放冷；加入飽和氯化鈉溶液10 mL，靜置分層；吸取上層清液，水洗滌3次，每次2 mL，上層液用無水硫酸鈉干燥，即得供試品溶液[7]。

2.3.2 GC-MS條件 色譜柱為ZB-5MSI 5%Phenyl-95%DiMethylpolysiloxane彈性石英毛細(xì)管柱（30m×0.25 mm×0.25 μm）；微量注射器注入1 μL甲酯化供試品溶液；柱溫為170℃，保持38 min，以10℃/min升溫至310℃，保持4 min，運行時間56 min；氣化室溫度為250℃；載氣為高純氦氣（He，純度：99.999%）；柱前壓為7.62 psi（1 psi＝6.895 kPa），載氣流量為 1.0 mL/min；不分流進樣，溶劑延遲時間為4.0 min；離子源為電子轟擊離子源（EI），離子源溫度為230℃；四極桿溫度為150℃；電子能量為70 eV；發(fā)射電流為34.6 μA；倍增器電壓為1 671 V；接口溫度為280℃；質(zhì)量范圍為29～500 amu（1 amu＝1.66×10－27kg）。

2.3.3 數(shù)據(jù)處理及質(zhì)譜檢索 取“2.3.1”項下供試品溶液，按“2.3.2”項下條件進樣測定。對總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計算機數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對Nis t2005和Wiley275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，確定油脂類代謝物的化學(xué)成分，并用峰面積歸一化法測定各化學(xué)成分的相對百分含量，結(jié)果見表1。

經(jīng)GC-MS分析鑒定，油脂類代謝物的成分主要為油酸（34.85%）、棕櫚酸（29.35%）、亞油酸（21.94%）和硬脂酸（10.87%）。其中，不飽和脂肪酸占57.13%，飽和脂肪酸占42.83%。

2.4 油脂類代謝物及其主要化學(xué)成分抗多藥耐藥菌活性的測定

2.4.1 菌液及樣品貯備液的制備 將復(fù)蘇后的試驗菌株用接種針挑取一環(huán)接種在MH（B）培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18 h，麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)節(jié)菌液的最終濃度為0.8×106～1.2×106CFU/mL。將油脂類代謝物和主要成分（油酸、棕櫚酸、亞油酸、硬脂酸對照品）分別制備成200、2 mg/mL的貯備液，將陽性對照品頭孢曲松鈉和AEPC分別制備成1 mg/mL和200 mg/mL（以提取物計）的貯備液，試驗時二倍稀釋至所需濃度。

2.4.2 抗多藥耐藥菌活性測定 參考美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會（CLSI 2015）標(biāo)準(zhǔn)[8]，采用96孔板微量稀釋法[9]檢測油脂類代謝物及其主要成分（以油酸、棕櫚酸、亞油酸、硬脂酸對照品進行試驗）對10株多藥耐藥菌株（肺炎克雷伯桿菌、普通變形桿菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌、奇異變形桿菌、屎腸球菌和鮑曼不動桿菌）的最低抑菌濃度（MIC），并用涂布平板法考察各樣品對10株多藥耐藥菌的最低殺菌濃度（MBC），以10%的二甲基亞砜（DMSO）無菌水溶液為陰性對照，試驗重復(fù)3次。A.terreus油脂類代謝物及其主要化學(xué)成分對10株多藥耐藥菌的MIC和MBC測定結(jié)果見表2。

由表2可以看出，A.terreus油脂類代謝物對多藥耐藥菌肺炎克雷伯菌、普通變形桿菌、大腸埃希菌、奇異變形桿菌和鮑曼不動桿菌具有抗菌活性，其中對大腸埃希菌的抗菌作用最強（MIC為12.5 mg/mL）。棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸和油酸均具有抑制多藥耐藥菌大腸埃希菌生長的作用，MIC范圍為0.5～1 mg/mL；棕櫚酸具有較為廣泛的抗菌作用，其中對屎腸球菌活性最強，MIC為0.25 mg/mL。

表2 A.terreus油脂類代謝物及其主要成分對10株多藥耐藥菌的MIC和MBC測定結(jié)果Tab 2 MICs and MBCs of A.terreus lipid metabolites and its main components against 10 strains of multi-resistant bacteria

2.5 細(xì)胞毒性測定

參考文獻[10]方法。將RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中，將細(xì)胞置于溫度為37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，以2×105個/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，棄去上清。對照組和試驗組（200、100、50 μg/mL的油脂類代謝物）分別加入100 μL完全培養(yǎng)液和相應(yīng)濃度的油脂類代謝物。培養(yǎng)24 h后，每孔加入MTS溶液10 μL，繼續(xù)孵育3～4 h后，于490 nm波長處測定光密度（OD）值，每組設(shè)6個平行孔，按照公式細(xì)胞存活率（%）＝OD試驗組平均值/OD對照組平均值×100%計算細(xì)胞存活率。結(jié)果，對照組和200、100、50 μg/mL油脂類代謝產(chǎn)物組細(xì)胞的存活率分別為100%、99.31%、100%、99.92%，可見油脂類代謝物在50～200 μg/mL范圍內(nèi)對RAW264.7細(xì)胞均無毒性（細(xì)胞存活率均≥99.31%）。

2.6 炎癥因子檢測

參考文獻[11]方法。參照“2.5.1”項下方法培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，棄上清，每孔加入100 μL無血清DMEM培養(yǎng)基，然后將細(xì)胞分為空白組、模型組（1 μg/mL LPS）、陽性組（1 μg/mL LPS+50 μg/mL地塞米松）和不同質(zhì)量濃度油脂類代謝物組（1 μg/mL LPS+50、100、200 μg/mL油脂類代謝產(chǎn)物），每組設(shè)6個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，吸取50 μL培養(yǎng)液上清至酶標(biāo)板中，加入等體積的Griess試劑，室溫反應(yīng)10 min后，于540 nm波長處測定各孔吸光度（A）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算一氧化氮（NO）的釋放量；TNF-α的釋放量采用ELISA法進行測定，具體操作按照相應(yīng)試劑盒說明書進行。采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析和t檢驗進行組間比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果見表3。

表3 各組細(xì)胞上清液中NO、TNF-α含量測定結(jié)果（±s，n＝6）Tab 3 Content determination of NO and TNF-α in supernatant in each group（±s，n＝6）

表3 各組細(xì)胞上清液中NO、TNF-α含量測定結(jié)果（±s，n＝6）Tab 3 Content determination of NO and TNF-α in supernatant in each group（±s，n＝6）

注：與空白組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與陽性組比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01Note：vs.blank group，＊＊P＜0.01；vs.model group，##P＜0.01；vs.positive group，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01

組別空白組模型組陽性組50 μg/mL油脂類代謝物組100 μg/mL油脂類代謝物組200 μg/mL油脂類代謝物組TNF-α，pg/mL 195.00±8.48 1 043.80±7.68＊＊428.20±9.38##784.75±24.04##Δ 728.80±31.45##Δ 150.18±21.64##ΔΔ NO，μmol/L 100.00±1.01 188.32±2.22＊＊110.65±1.17##184.26±4.79 146.19±7.41##114.21±1.01##

由表3可知，與空白組比較，模型組細(xì)胞上清液中NO、TNF-α含量顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，陽性組和100、200 μg/mL油脂類代謝物組細(xì)胞上清液中NO含量顯著減少（P＜0.01），且200 μg/mL油脂類代謝物組含量與陽性組相當(dāng)；陽性組和各質(zhì)量濃度油脂類代謝物組細(xì)胞上清液中TNF-α含量均顯著減少（P＜0.01），且200 μg/mL油脂類代謝物組含量低于陽性組（P＜0.01）。

3 討論

隨著人們生活水平的提高，油脂類成分已經(jīng)不僅僅是作為能量的來源，更是參與人類生活與健康的重要組成部分[12]?，F(xiàn)代藥理研究表明，油脂類成分具有多種藥理活性，如亞油酸有抑制結(jié)核分枝桿菌的活性[13]；棕櫚酸、肉豆蔻酸、亞油酸等多種脂肪酸可對金黃色葡萄球菌顯示出較高的抑制作用[14]；白木香內(nèi)生真菌Aspergillus SPA14的油脂類成分對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和白色念珠菌均表現(xiàn)出抑制作用[15]。本研究顯示，頭花蓼內(nèi)生真菌A.terreus中有豐富的油脂類成分，并發(fā)現(xiàn)其具有抗多藥耐藥菌的作用，尤其對革蘭氏陰性菌（如肺炎克雷伯菌、普通變形桿菌、大腸埃希菌、奇異變形桿菌和鮑曼不動桿菌）具有較強的抗菌活性，且油脂類代謝物比AEPC在抗多藥耐藥菌肺炎克雷伯桿菌、大腸埃希菌和鮑曼不動桿菌方面活性更強。但油脂類代謝物僅對測試耐藥菌株肺炎克雷伯桿菌、大腸埃希菌和鮑曼不動桿菌具有活性，而AEPC對測試耐藥菌株普通變形桿菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、陰溝腸桿菌、奇異變形桿菌和屎腸球菌具有活性，因此油脂類代謝物顯示出比AEPC更窄的抗菌活性范圍。

泌尿系統(tǒng)感染主要是因病原菌感染而引起的一類疾病，當(dāng)尿路組織或其表皮受到病原菌感染后會產(chǎn)生一系列的炎癥反應(yīng)，而尿路炎癥是泌尿系統(tǒng)感染的重要特征。因此，基于炎癥輔助治療也是治療泌尿系統(tǒng)感染的重要方法之一[16]，本研究采用體外經(jīng)典抗炎活性檢測方法，考察油脂類代謝物對細(xì)胞分泌炎癥因子NO和TNF-α的影響。結(jié)果表明，花蓼內(nèi)生真菌A.terreus油脂類代謝物在質(zhì)量濃度為100、200 μg/mL時均能顯著抑制細(xì)胞釋放炎癥因子NO和TNF-α，提示其中的油脂類成分對治療泌尿系統(tǒng)感染具有輔助治療的效果。

本研究表明，頭花蓼內(nèi)生真菌A.terreus中油脂類成分具有抗多藥耐藥菌和抗炎活性，表現(xiàn)出其代謝成分與頭花蓼藥材功能相似的特性，這為頭花蓼及其內(nèi)生菌資源在治療泌尿系統(tǒng)感染疾病方面的進一步研究及應(yīng)用提供了參考。

[1]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大字典：上冊[M].上海：上?？萍汲霭嫔纾?005：611-612.

[2]FIHN SD.Acute uncomplicated urinary tract infection in women[J].N Engl J Med，2003，349（3）：259-266.

[3]WANG A，NIZRAN P，MALONE MA，et al.Urinary tract infections[J].Prim Care，2013，40（3）：687-706.

[4]ROSSOLINI GM，ARENA F，PECILE P，et al.Update on the antibiotic resistance crisis[J].Curr Opin Pharmacol，2014，18（4）：56-60.

[5]PADHI L，MOHANTAYK，PABDASK.Endophytic fungi with great promises：a review[J].J Adv Pharm Edu&Res，2013，3（3）：152-170.

[6]徐國波，劉俊，肖耀華，等.球毛殼菌CIB-160次生代謝產(chǎn)物的分離鑒定及其免疫活性[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2016，28（10）：1562-1567.

[7]MUHAMMAD T，SAQIB A，F(xiàn)IAZ A，et al.Identification，F(xiàn)T-IR，NMR（1H and 13C）and GC/MS studies of fatty acid methyl estersin biodiesel from rocket seed oil[J].Fuel Process Technol，2011，92（3）：336-341.

[8]CLSI.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing：twenty-fifth informational supplement CLSI document M100-S25[S].Wayne，PA：Clinical and Laboratory Standards Institute，2015.

[9]崔玉瑩，王憲貝，李玉坤，等.金銀花、連翹水煎液對金黃色葡萄球菌的抑制作用研究[J].光明中醫(yī)，2017，32（18）：2637-2638.

[10]WANG P，HENNING SM，HEBER D.Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols[J].PLoS One，2010，5（4）：10202-10212.

[11]毛艷，賀金華，蔡曉翠，等.維藥神香草提取物體外抗炎作用的譜效關(guān)系研究[J].中國藥房，2017，28（10）：1364-1367.

[12]IBARGUREN M，LOPEZ DJ，ESCRIBA PV.The effect of natural and synthetic fatty acids on membrane structure，microdomain organization，cellular functions and human health[J].Biochim Biophys Acta，2014，1838（6）：1518-1528.

[13]ESQUIVEL-FERRINO PC，F(xiàn)ABELA-HERNANDEZ JMJ，GARAZA-GONZALEZ E.et al.Antimycobacterial activity of constituents from Foeniculum vulgare var.dulce grown in Mexico[J].Molecules，2012，17（7）：8471-8482.

[14]KELSEY JA，BAYLES KW，SAHFII B，et al.Fatty acids and monoacylglycerols inhibit growth of Staphylococcus aureus[J].Lipids，2006，41（10）：951-961.

[15]彭可，梅文莉，吳嬌，等.白木香內(nèi)生真菌Aspergillus sp.A14的揮發(fā)性成分及其抗菌活性[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2011，23（1）：85-88.

[16]GORAN B，BJOM W，CATHARINA S.Escherichia coli，fimbriae，bacterial persistence and host response induction in the human urinary tract[J].Int J Med Microbiol，2005，295（6）：487-502.