豬舍環(huán)境氣載大腸桿菌主要毒力基因的檢測

段會勇

（泰山職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山東 泰安 271000）

空氣是人類和畜禽賴以生存的重要因素之一。微生物對人類和畜禽健康及生產(chǎn)性能的影響在很多情況下是通過空氣污染造成的，空氣微生物的污染程度是衡量空氣質(zhì)量的重要標(biāo)志之一[1]。微生物是動物舍環(huán)境污染的主要因素，動物舍的生物污染可以引起一系列傳染病的流行。動物舍空氣中的細(xì)菌包括致病菌、條件性致病菌和非病原菌[2]，它們在一定程度上均可導(dǎo)致動物或飼養(yǎng)員的感染[3]；甚至極少量的致病菌就可直接導(dǎo)致呼吸道的感染，特別是下呼吸道的感染[2]。所以，空氣中微生物氣溶膠的污染，不僅能夠影響人及其他動物的健康，而且使一些傳染性人獸共患疾病病原體在人和動物間傳播[4-5]。

大腸埃希氏菌是人和動物腸道中的一種共棲菌，在特定條件下可致大腸桿菌病，并能夠隨著糞便排出而污染環(huán)境。因此，大腸埃希氏菌是農(nóng)業(yè)環(huán)境、水、食品等污染的重要指示細(xì)菌[6-8]。大腸埃希氏菌在空氣中，特別是在動物舍及其周圍環(huán)境中是一種常見菌[9-10]。

動物舍環(huán)境中的微生物及其代謝產(chǎn)物形成的氣溶膠不僅能夠?qū)е颅h(huán)境污染，影響動物的健康及生產(chǎn)性能，而且還能導(dǎo)致氣源性傳染病的流行。過去對畜禽養(yǎng)殖環(huán)境微生物氣溶膠傳播的研究主要是通過舍內(nèi)外環(huán)境中的細(xì)菌濃度的變化以及細(xì)菌耐藥性及某些致病菌含量等方面來確認(rèn)的，很少利用分子生物學(xué)手段研究畜禽舍微生物氣溶膠向環(huán)境的傳播。本試驗通過多重PCR方法調(diào)查了不同豬舍內(nèi)外環(huán)境中大腸桿菌的5種主要毒素基因的攜帶情況，而且還通過對舍內(nèi)、舍外環(huán)境中大腸桿菌的5種主要毒素基因的比較檢測分析，研究舍內(nèi)大腸桿菌5種主要毒素基因向舍外環(huán)境中的傳播。

1 材料和方法

1.1 豬舍情況

本研究于2015年6月至2017年6月在泰安和萊蕪5個不同養(yǎng)豬場，分別設(shè)點采樣，風(fēng)速、溫度及相對濕度在取樣開始、中間及即將結(jié)束時分別測量。豬舍的具體情況分別見表1。

表1 豬舍物理指標(biāo)

1.2 樣本的采集

利用Andersen-6級撞擊式和LWC-I離心式空氣微生物采樣器收集空氣樣品?？諝鈽悠贩謩e取其舍內(nèi)、舍外上風(fēng)（10 m和50 m）、舍外下風(fēng)方向（10 m、50 m、100 m、200 m、400 m）。采集時間根據(jù)環(huán)境衛(wèi)生狀況不同掌握在1～5 min之間，盡量使每個平板上的菌落數(shù)在30～300為宜。每個豬舍設(shè)3點采樣，每次重復(fù)采集5個樣本。每一個豬舍在采集空氣樣本的同時隨機(jī)采集了10～15個糞便樣本。

1.3 空氣中大腸桿菌的分離、鑒定與濃度計算

用麥康凱3號培養(yǎng)基采集的樣本（平板和試條）在37℃條件下培養(yǎng)24 h后，所有的紅色菌落經(jīng)過“KOH反應(yīng)”試驗鑒定其是革蘭氏陰性菌還是革蘭氏陽性菌。所有革蘭氏陰性短桿菌再在麥康凱培養(yǎng)基上進(jìn)行一次純分離培養(yǎng)，通過普通的生化試驗進(jìn)行鑒定，不確定的菌株再用API 20 E（Bio Merieux,Marcy-I'Etoile,France）鑒定，統(tǒng)計大腸桿菌的數(shù)量，并根據(jù)公式①計算出每立方米空氣中大腸桿菌的含量（CFU/m3），最后將含20%甘油的肉湯培養(yǎng)物保存在-20℃冰箱中。

其中Q1為六節(jié)平皿上菌落數(shù)量矯正后的總和，t為采樣時間（min）。

1.4 糞便中大腸桿菌的分離、鑒定與濃度計算

取糞便樣本約0.5 g，加入預(yù)先盛有4.5 mL檢樣稀釋液的滅菌青霉素小瓶中，用同樣稀釋液對樣品做連續(xù)10倍遞進(jìn)稀釋至10-6。用移液器（50 μL）從高稀釋度開始，滴種麥康凱培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)基用3個平板，每個平板上滴3個稀釋度，每個稀釋度3滴，每滴之間間隔一定距離成3×3方陣形。37℃培養(yǎng)18～20 h后按照可數(shù)性原則對相同稀釋度的3滴樣本的菌落進(jìn)行計數(shù)，選擇合適的稀釋度，按下列公式②計算每克樣品所含細(xì)菌數(shù)。

根據(jù)Lim介紹的方法[11]，將稀釋液先接種到伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)18～20 h，挑取黑色帶金屬閃光的菌落接種到麥康凱3號（OXOID）培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)18～20 h后，每一平板挑取1～2個典型紅色菌落，并根據(jù)1.3方法鑒定保存。

1.5 大腸桿菌培養(yǎng)及模板DNA的提取

1.5.1 大腸桿菌培養(yǎng) 取試驗中分離提純后保存的菌種，接種于麥康凱培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h后，挑取生長的單個粉紅色菌落接種于LB肉湯中，37℃培養(yǎng)過夜。

1.5.2 模板制備 將大腸桿菌接種到5 mL LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)18 h。然后取出培養(yǎng)液1.5 mL 10 000 r/min離心2 min，棄掉上層液體，用100 μL TE緩沖液洗滌2次，去掉洗滌液，最后再用100 μL TE緩沖液懸浮沉淀，在100℃條件下煮沸10 min，再迅速冰浴5 min，最后12 000 r/min離心2 min，取出上清液作為模板在-20℃條件下保存?zhèn)溆?。參考菌?C83600（STb、LTa），C83710（STa），H30（Stx1），SDZ21（LTa、Stx2），SDZ15（Stx2）由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防系實驗室保存。

1.6 PCR 反應(yīng)

1.6.1 引物的合成 引物均由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表2。

表2 試驗中所用引物序列

1.6.2 反應(yīng)條件 ERIC-PCR反應(yīng)體系由以下成分組成：1×buffer，200 μmol dNTPs，1.5 U Taq DNA 聚合酶，1.5 mmol MgCl2（TaKaRa），5對引物各25 pmol，2 L模板DNA，最后用滅菌雙蒸水補(bǔ)充至25 μL。反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性 3 min，94℃變性 30 s，58～54℃（每兩個循環(huán)下降1℃）復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，共32個循環(huán)，72℃延伸10 min結(jié)束反應(yīng)。進(jìn)行電泳之前，所有PCR反應(yīng)產(chǎn)物在4℃條件下保存。

1.6.3 電泳 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳分離（1xTAE為電泳緩沖液，EB染色，3 V/cm條件下電泳 1～2 h），以 DL 2 000 Marker（TaKaRa）作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，電泳結(jié)果在紫外分析儀上照相。

2 結(jié)果

2.1 豬舍環(huán)境中大腸桿菌5種主要毒素基因的檢測結(jié)果

圖1顯示了在同一PCR反應(yīng)條件下，5種毒素基因的檢測結(jié)果，它們可以分別擴(kuò)增出各自的條帶。5 種不同毒素基因 STa、STb、LTa、Stx1 和 Stx2/Stx2e擴(kuò)增條帶的大小分別為 183 bp、360 bp、282 bp、664 bp和484 bp。圖2顯示了用多重PCR法檢測大腸桿菌5種毒力基因的攜帶情況。

圖1 多重PCR對大腸桿菌5種毒素基因的檢測結(jié)果

圖2 多重PCR對大腸桿菌5種毒素基因的檢測結(jié)果

由表3可知，在檢測的5個豬舍環(huán)境中的120株大腸桿菌中，很多菌株僅僅攜帶1個毒素基因：有11.67%（14/120） 的菌株攜帶 LTa 基因，17.50%（21/120）的菌株攜帶 STb 基因，1.67%（2/120）的菌株攜帶 STa基因，5.00%（6/120）的菌株攜帶 Stx2/Stx2e基因。但是，很多菌株攜帶2個或2個以上的毒素基因：攜帶STa+STb、STa+STb+LTa和STb+LTa+STx1菌株都占 3.33%（4/120），還有 6.67%（8/120）的菌株攜帶 STa+LTa基因，5.83%（7/120）的菌株攜帶 LTa+Stx2/Stx2e 基因，1.67%（2/120） 的菌株攜帶 STa+LTa+STx1 基因，2.50%（3/120）的菌株攜帶 STa+STb+LTa+STx1 基因，并且還有 37.50%（45/120）的大腸桿菌沒有檢出這5種毒素基因。結(jié)果也同時表明，攜帶LTa基因和STb基因的菌株最多，分別為35.00%（42/120）和 30.00%（36/120）。

表3 豬舍環(huán)境中大腸桿菌5種主要毒素基因的檢測結(jié)果

2.2 豬舍內(nèi)外大腸桿菌5種主要毒素基因的比較

通過比較發(fā)現(xiàn)，有很多從舍內(nèi)分離的大腸桿菌與糞便中分離的大腸桿菌攜帶相同的毒力基因，比如：在豬舍A內(nèi)，大腸桿菌indoor（舍內(nèi)）-3，-4與feces（舍外）-6；在豬舍B內(nèi)，大腸桿菌indoor-1與feces-9；在豬舍C內(nèi)，大腸桿菌indoor-5與feces-7，indoor-3與feces-2；在豬舍D內(nèi)，indoor-9與feces-5；在豬舍E內(nèi)，indoor-3與feces-5，等等。另外，很多從下風(fēng)方向分離到的大腸桿菌與舍內(nèi)分離的大腸桿菌或糞便中分離的大腸桿菌也攜帶相同的毒力基因，如：在豬舍B內(nèi)，downwind10 m（下風(fēng)方向10 m）-1與indoor-8；在豬舍 C 內(nèi)，downwind10 m-2 與 feces-5，downwind50 m（下風(fēng)方向 50 m）-2 與 feces-6，downwind10 m-3與feces-9；在豬舍D內(nèi)，downwind10m-1與feces-8和indoor-7；在豬舍E內(nèi)，downwind10 m-3與feces-6。但是，在5個豬舍中，有一些從舍外下風(fēng)分離到的大腸桿菌與舍內(nèi)分離的大腸桿菌或糞便中分離的大腸桿菌的攜帶毒力基因并不相同，所以，這些下風(fēng)分離株應(yīng)當(dāng)不是來源于舍內(nèi)空氣。

3 討論

大腸埃希氏菌是引起動物腹瀉與死亡的重要病原體，自Kaufmann在21世紀(jì)50年代建立的大腸埃希氏菌血清型分類系統(tǒng)以來，血清型一直作為致瀉性大腸埃希氏菌的鑒定依據(jù)及流行病學(xué)調(diào)查的標(biāo)志。而大腸埃希氏菌的毒力主要取決于是否攜有相應(yīng)的毒素，因此毒素的檢測成為鑒別病原性大腸埃希氏菌的重要依據(jù)。

本試驗采用多重PCR方法，以多對引物在同一反應(yīng)體系中擴(kuò)增幾種不同的毒素基因，可簡化操作步驟，縮短時間，快速定型。本試驗根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的序列設(shè)計了5種大腸桿菌腸毒素基因特異引物，并建立了Multiplex-PCR方法，旨在用于動物舍環(huán)境中大腸桿菌毒素基因的分子流行病學(xué)調(diào)查，并研究動物舍舍內(nèi)大腸桿菌毒素基因向舍外環(huán)境中的傳播。

通過對不同豬舍舍內(nèi)及其環(huán)境中大腸桿菌毒素基因的檢測可以看出，在攜帶這5種毒素基因的所有大腸桿菌中，攜帶LTa基因的菌株最多，而且絕大多數(shù)大腸桿菌攜帶2種或2種以上的毒素基因，攜帶Stx2/Stx2e毒素基因的菌株最少。本試驗結(jié)果表明，用建立的Multiplex-PCR方法不僅能同時檢測并區(qū)分大腸桿菌的這5種毒素基因類型，而且能檢測一種或任何組合的毒素基因，這對大腸桿菌毒素類型的快速普查具有重要的應(yīng)用價值，對臨床診斷具有一定的指導(dǎo)意義。

通過對豬舍舍內(nèi)（動物糞便和舍內(nèi)空氣）及其內(nèi)外環(huán)境中大腸桿菌毒力基因的檢測結(jié)果比較后可以看出，舍外環(huán)境中的，特別是下風(fēng)中檢測的大腸桿菌其攜帶的毒力基因類型與舍內(nèi)或動物糞便中的大腸桿菌其攜帶的毒力基因類型相同。因此，我們可以推測其是豬舍環(huán)境中的大腸桿菌傳播到舍外環(huán)境。這對牧場周邊環(huán)境可能造成一定污染，對波及到的牧場豬群或鄰近的居民的健康構(gòu)成潛在的危害，其程度及機(jī)制有待進(jìn)一步研究。以大腸桿菌作為一種指示菌來研究豬舍中微生物氣溶膠向周圍環(huán)境的傳播，具有獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)和流行病學(xué)意義。

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