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    野生番茄愈傷生長特性研究

    2018-06-11 05:31石穎王桂英王長娜劉俠闞玉文郜秋華張恭車文利龐國新
    安徽農業(yè)科學 2018年35期
    關鍵詞:愈傷組織生長特性

    石穎 王桂英 王長娜 劉俠 闞玉文 郜秋華 張恭 車文利 龐國新

    摘要?以秘魯野生細葉番茄為試材,采用不同植物激素組合及不同光照對比培養(yǎng)方法,對野生番茄愈傷組織誘導及愈傷生長特性進行了研究。結果表明,MS+6-BA (0.05~2.0 ) mg/L +NAA 0.5 mg/L、MS+NAA 0.5 mg/L或2,4-D 0.5 mg/L均可誘導葉片及莖段愈傷化。不同光照條件(強光、弱光及黑暗培養(yǎng))下愈傷發(fā)生顏色變化。無論光照或暗培養(yǎng),愈傷組織增生速度均較快,20 d生長量為原來的3~14倍。根據(jù)定性和定量調查確定MS+NAA 0.5 mg/L為秘魯野生細葉番茄愈傷光培養(yǎng)或暗培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基。該研究為野生番茄在基因工程上的利用奠定了技術基礎。

    關鍵詞?秘魯野生細葉番茄;愈傷組織;植物激素;生長特性

    中圖分類號?S641.2文獻標識碼 A文章編號?0517-6611(2018)35-0047-03

    番茄(Solanum lycopersicum L.)作為重要的蔬菜作物和模式植物,在諸多方面已有研究報道,如在生理生化上對于野生與栽培番茄的耐鹽性研究[1-3];利用子葉和下胚軸等外植體誘導植株再生[4-5];在基因工程方面抗逆、抗病、耐儲藏等基因的遺傳定位、克隆[6-9];以及農桿菌介導的抗病、抗蟲、耐鹽、耐除草劑等基因的遺傳轉化[10-13]。栽培番茄通常具有較高的商品性狀,但易受逆境脅迫和病蟲侵害。而野生番茄則是抗病、耐鹽、耐冷、耐貯藏等抗逆基因及抗線蟲、晚疫病、病毒病等抗病蟲基因的主要來源[7-8]。目前野生番茄的種類較多,如細葉番茄(S.pimpinellifolium)、秘魯番茄(S.peruvianum)、多毛番茄(S.habrochaites)、潘那利番茄(S.pennellii)、小花番茄(S.neorickii)等[14],其中細葉番茄生長于秘魯,它和栽培番茄可以相互雜交,親緣非常接近,是惟一表現(xiàn)出與栽培番茄有天然漸滲現(xiàn)象的野生種。該研究對秘魯野生細葉番茄(S.pimpinellifolium)的愈傷組織培養(yǎng)特性進行研究,以期為野生番茄基因工程中的利用提供基礎性資料。

    1?材料與方法

    1.1?植物材料?秘魯野生細葉番茄(S.pimpinellifolium),來源于廊坊市農林科學院作物研究所。

    1.2?培養(yǎng)基?愈傷誘導培養(yǎng)基參照文獻[15-16]及多年組培經驗設計,以MS為基本培養(yǎng)基,每升添加瓊脂粉5.5 ~6.0 g,白糖30 g,調pH至5.8~6.0。愈傷組織誘導激素為6-BA、NAA和2,4-D。培養(yǎng)基編號及配方如下:① MS+ 6-BA 0.05 mg/L+NAA 0.5 mg/L;② MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L;③ MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L;④ MS+NAA 0.5 mg/L;⑤ MS+2,4-D 0.5 mg/L。

    1.3?方法?愈傷組織誘導培養(yǎng)基確立:利用野生細葉番茄組培苗葉片和莖段等外植體,放置于添加不同激素的培養(yǎng)基上,觀察愈傷誘導及繼代生長情況,篩選確立出愈傷培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基。

    野生細葉番茄愈傷細胞生長速度量化調查:將番茄愈傷接種時先稱重,接種到④和⑤中,每種培養(yǎng)基各接種4瓶,每瓶4團愈傷,接種后將愈傷團按重量由輕到重分別編號為1~16號。光照下(2 000 lx,12 h/d)培養(yǎng)20 d后再次稱重,數(shù)據(jù)錄入到Excel中進行分析,明確野生番茄固體培養(yǎng)的生長速度。

    愈傷在不同光照條件下的生長特性研究:選擇在同一培養(yǎng)基上(MS+6-BA 0.05 mg/L+NAA 0.5 mg/L)多次繼代、顏色質地均勻的愈傷,接種到培養(yǎng)基④上,進行光照培養(yǎng)(2 000 lx,12 h/d)、弱光培養(yǎng)(500 lx,8 h/d)和暗培養(yǎng)(全天無光照)。培養(yǎng)20 d時,觀察記錄愈傷細胞顏色變化,接種后和調查時均拍照。

    2?結果與分析

    2.1?不同培養(yǎng)基愈傷誘導?葉片和莖段等外植體在上述培養(yǎng)基中會逐漸愈傷化,經在相同培養(yǎng)基上繼代轉接,①~⑤號培養(yǎng)基均可誘導愈傷組織產生(表1)。其中①和②③對比,①中的愈傷生長速度較快,細胞相對疏散,顏色為米黃色,②號淡綠色,③號愈傷最綠。④和⑤培養(yǎng)基對比,④上誘導的愈傷顏色為白綠色,生長速度相對較快。

    在①~③中繼代轉接,14d后愈傷即長滿瓶。①號中愈傷越來越疏松,顏色變淺,③號中愈傷較為致密、硬。這3種

    培養(yǎng)均添加NAA0.5 mg/L,差別是6-BA濃度由0.05 mg/L→0.5 mg/L→2 mg/L。愈傷組織在④號和⑤培養(yǎng)基中繼代轉接,④號愈傷白中帶綠;⑤號愈傷也微有綠色,有暗色細胞出現(xiàn),表現(xiàn)水漬狀。圖中⑥是接種初愈傷形態(tài)及顏色。

    2.2?野生細葉番茄愈傷細胞生長速度?光照下培養(yǎng)20 d后,1~16號愈傷團均按照接種初愈傷重量由輕到重排列。由圖中數(shù)據(jù)分析可看出:不同愈傷團的凈增長量存在差別,按照接種初重量由低到高升序排列,20 d后的重量卻沒有出現(xiàn)規(guī)則的升序排列狀態(tài)??傮w是:④生長量是原來的3~14倍,⑤生長量是原來的3~10倍。

    取出愈傷破壞性調查:⑤上的愈傷水分含量高,水漬狀;④相對較干,為濕沙狀。從顏色看:⑤上的愈傷有較多變黑細胞;④細胞色淺,米白色,顏色相對均勻。綜合分析,選擇④作為番茄愈傷繼代培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基。

    2.3?不同光照下愈傷生長對比?愈傷組織在強光、弱光及完全黑暗培養(yǎng)20 d時調查,最初接種的淺白愈傷團表現(xiàn)出3種顏色:淺白色、暗黑色和黃褐色。變黑及褐化程度上:強光>弱光>全黑暗。強光下多數(shù)愈傷為白色,呈現(xiàn)黑色的極少,有個別愈傷團為微黃色。弱光及全黑暗白色愈傷相對少,黑化及褐化較多。3種光照條件下繼續(xù)培養(yǎng)30 d,黑色及黃褐色進一步加深,有的整瓶愈傷變黑色或黃褐色。黑暗培養(yǎng)的愈傷挑選其中的色淺細胞轉接繼續(xù)暗培養(yǎng),細胞生長出現(xiàn)好轉,淺色多,也有微黑出現(xiàn)。

    由不同光照下愈傷培養(yǎng)變化可以看出:經過20 d的培養(yǎng),番茄愈傷在光照下培養(yǎng),新生組織多為白色,少數(shù)出現(xiàn)黑色和乳黃色。在弱光或完全黑暗下,新生細胞黑色與淺色混雜,且黑色細胞較多,也有不發(fā)黑但為乳黃色的細胞團。挑選淺色細胞黑暗繼代培養(yǎng),經多次繼代后可獲得穩(wěn)定的白色愈傷,不再發(fā)生顏色改變。

    3?結論與討論

    秘魯野生細葉番茄外植體愈傷誘導較易,NAA 0.5 mg/L單獨使用或配合6-BA (0.05~?2.0 mg/L)均可使葉片莖段等材料愈傷化,但隨著6-BA濃度的升高,愈傷由松散變得致密,顏色由淡綠變?yōu)闈饩G。

    愈傷組織無論光照或暗培養(yǎng),細胞增生速度均很快,20 d生長量為原來的3~14倍。根據(jù)定性和定量調查確定MS+NAA 0.5 mg/L為秘魯野生細葉番茄愈傷光或暗培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基。光照條件下培養(yǎng),新生組織多為白色,少數(shù)細胞團整體表現(xiàn)乳黃色。在弱光或完全黑暗條件下,新生細胞黑色與淺色混雜,也有不發(fā)黑但整體為乳黃色的細胞團。挑選淺色細胞團繼代培養(yǎng)變黑現(xiàn)象減輕。白色和乳黃色細胞團為顆粒狀,用鑷子碰觸有沙沙音;黑色細胞團為絮狀,碰觸無聲音,初步判斷細胞已死。細胞團出現(xiàn)整體而不是部分黑化及乳黃色,應該與某種物質的產生及傳遞有關,具體機制及原因不明。

    愈傷在增生速度與顏色上出現(xiàn)的變化及差異,原因在于番茄愈傷由不同組織誘導出,細胞也處于混雜狀態(tài),因此,繼代轉接時需要進行篩選淘汰。經過篩選可獲得增生穩(wěn)定、顏色均一的愈傷。無論是光照培養(yǎng)或暗培養(yǎng),細胞增生速度均很快,所以轉接周期不宜太長,以15~20 d一個周期為宜。

    參考文獻

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