ATP發(fā)光法在日化產(chǎn)品抗菌抑菌快速檢測(cè)方面應(yīng)用的可行性研究

邱皓璞 張弛 王曉麗 朱榮

摘 要：以日化產(chǎn)品作為檢測(cè)對(duì)象，以QB/T 2738-2012中對(duì)日化產(chǎn)品抗菌抑菌效果的檢驗(yàn)方法為基礎(chǔ)，通過ATP發(fā)光法與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中懸液定量法的對(duì)比，對(duì)ATP發(fā)光法在快速檢測(cè)日化產(chǎn)品的抗菌抑菌性的應(yīng)用上的可行性及準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)價(jià)。為國家對(duì)日化產(chǎn)品的監(jiān)管提供新技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：ATP發(fā)光法，快速檢測(cè)，日化產(chǎn)品，抗菌抑菌性

在輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 2738-2012中規(guī)定了日化產(chǎn)品中抗菌抑菌性的檢測(cè)方法：懸液定量法和抑菌環(huán)法。但這兩種方法都存在弊端，懸液定量法是利用細(xì)菌懸液進(jìn)行常規(guī)微生物培養(yǎng)基培養(yǎng)后進(jìn)行計(jì)數(shù)，耗時(shí)較長(zhǎng)。抑菌環(huán)法則是使用量取抑菌環(huán)大小的方法來測(cè)定產(chǎn)品中的微生物指標(biāo)，容易受外界影響，結(jié)果準(zhǔn)確性低。

三磷酸腺苷（ATP）是一種存在于活著的所有生物細(xì)胞中的化學(xué)物質(zhì)，活菌中含有一定量的ATP，如1個(gè)革蘭氏陽性菌的ATP含量約為1*10-18 g，革蘭氏陰性菌是陽性菌的10倍，而酵母又是革蘭氏陰性菌的10倍。ATP、熒光素、氧氣，在Mg2+存在的條件下與熒光素酶發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)行發(fā)光。

由于其發(fā)光量根據(jù)ATP量的比例進(jìn)行，因此可以通過測(cè)定發(fā)光量來測(cè)定生物由來的ATP量，其檢出限在細(xì)菌數(shù)102～103 cfu/mL。有研究表明ATP發(fā)光量與活菌數(shù)之間有較好的線性關(guān)系，且其在細(xì)胞死亡后極易降解的特性，使其成為較好的活菌的檢測(cè)指標(biāo)。目前ATP發(fā)光法已經(jīng)在國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于在牛乳、豆腐等無細(xì)胞食品和水質(zhì)、工作臺(tái)面等環(huán)境中活菌的檢測(cè)。因此，在日化產(chǎn)品的抗菌抑菌性檢測(cè)方面的應(yīng)用也值得期待。

材料與方法

1 儀器與材料

1.1主要儀器：3MTMClean-TraceTMATP熒光檢測(cè)系統(tǒng)（3M公司），3MTMClean-TraceTMATP水質(zhì)采樣棒（3M公司）

1.2其它儀器及試劑：高壓滅菌鍋（TOMY SX-700）、生化培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠SPX-250B-Z型MODEL SPX-250B-Z）、旋渦混合器、一次性滅菌平皿、1000μl，200μl移液槍及滅菌槍頭、 營養(yǎng)肉湯（北京陸橋）、營養(yǎng)瓊脂（北京陸橋）。

1.3實(shí)驗(yàn)菌種：大腸桿菌（E.coil） ATCC 25922（American type culture collection）、金黃色葡萄球菌（S. aureus）ATCC 6538（American type culture collection）

1.4檢驗(yàn)樣品來源：來自市場(chǎng)的不同品牌和種類的洗手液，洗滌劑，洗潔精等產(chǎn)品如寶潔，白貓，聯(lián)合利華，雕牌，浪奇，綠傘，滴露，威露士，汰漬，藍(lán)月亮，奧妙，超能，花王，奇強(qiáng)，舒膚佳，六神等著名日化品牌的產(chǎn)品。

2 方法

2.1 ATP發(fā)光法檢測(cè)與懸液定量法的關(guān)聯(lián)性判定

通過ATP熒光檢測(cè)儀測(cè)定不同稀釋梯度的菌種懸液，并將各組數(shù)據(jù)匯總統(tǒng)計(jì)。再將繼續(xù)稀釋至一定范圍的菌種懸液用懸液定量法，36℃，48h培養(yǎng)后計(jì)算CFU值，與ATP發(fā)光值進(jìn)行對(duì)比。

2.2 ATP發(fā)光檢測(cè)方法與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法的對(duì)比試驗(yàn)

行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)具體方法參照QB/T 2738-2012中的懸液定量法，制備細(xì)菌繁殖體懸液，用合適的中和試劑稀釋菌種懸液樣品，與待測(cè)樣品反應(yīng)后，稀釋至相應(yīng)的濃度，倒入培養(yǎng)基，同時(shí)進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過37℃，48h培養(yǎng)后，對(duì)平板上形成 的單菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)（cfu/mL）。

ATP發(fā)光法檢測(cè)一定濃度的菌種懸液，加入待測(cè)抗菌抑菌產(chǎn)品，反應(yīng)與懸液定量法相同時(shí)間，將ATP水質(zhì)采樣棒放入試管中取樣，用ATP熒光檢測(cè)儀進(jìn)行讀取數(shù)據(jù)。

3 數(shù)據(jù)處理與分析

將菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)得的值及ATP方法測(cè)得值，按照（消毒前菌液濃度-消毒后菌液濃度）/消毒前菌液濃度，得出抑菌抗菌率。將行標(biāo)方法計(jì)算的抑菌抗菌率與ATP方法計(jì)算的殺菌率進(jìn)行pearson相關(guān)系數(shù)的計(jì)算。當(dāng)p值<0.05，則判斷2個(gè)方法的值相關(guān)，ATP發(fā)光法具有可行性，反之則無可行性。

結(jié)果

1 ATP發(fā)光法檢測(cè)與懸液定量法的關(guān)聯(lián)性判定

ATP發(fā)光值與活菌菌落數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。如fig.1和fig.2所示，菌液在1*103～9*105cfu/mL濃度范圍內(nèi)，無論E.coil（R2=0.9999）還是S. aureus（R2=0.9998）

2 ATP快速檢測(cè)法與懸液定量法計(jì)算抗菌抑菌性值對(duì)比

結(jié)果見表1。ATP發(fā)光方法計(jì)算的殺菌率的值與懸液定量法計(jì)算的值進(jìn)行比較，peason相關(guān)系數(shù)分別為0.998（E.coil）和0.999（S. aureus），p值分別為0.000和0.000，小于0.05，表現(xiàn)出較強(qiáng)的相關(guān)性。

討論

3MTMClean-TraceTM ATP熒光檢測(cè)系統(tǒng)的有效菌液測(cè)定范圍在1*103～9*105cfu/mL，比傳統(tǒng)的ATP發(fā)光法測(cè)定的值相比，測(cè)定值與測(cè)定范圍都較低，這應(yīng)該與水質(zhì)采樣棒的采樣方法相關(guān)。但與傳統(tǒng)的ATP方法相同，運(yùn)用ATP快速檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行抗菌抑菌性的檢測(cè)與懸液定量法得到的結(jié)果具有較高的相關(guān)性（p=0.000）。這是因?yàn)锳TP快速檢測(cè)系統(tǒng)，雖然在菌液濃度的有效測(cè)量范圍上比ATP傳統(tǒng)方法測(cè)得值低且范圍小，但由于抗菌抑菌性的計(jì)算方式，因此在運(yùn)用ATP快速檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)量抗菌抑菌性時(shí)，并不會(huì)對(duì)結(jié)果造成影響。且在檢測(cè)時(shí)間上ATP快速檢測(cè)系統(tǒng)可以在1分鐘內(nèi)完成抗菌抑菌性的檢測(cè)，比傳統(tǒng)的ATP發(fā)光法更加快速，而傳統(tǒng)的懸液定量法至少需要48小時(shí)。在檢測(cè)方法上， ATP快速熒光檢測(cè)系統(tǒng)也比懸液定量法更為簡(jiǎn)便，可以同時(shí)進(jìn)行大批量的檢測(cè)，而懸液定量法由于操作上的局限性，步驟更為繁瑣，也無法同時(shí)進(jìn)行大批量操作。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，ATP 生物發(fā)光法比傳統(tǒng)的懸液定量法更為快速、方便，可以應(yīng)用于日化產(chǎn)品抗菌抑菌性的快速檢測(cè)領(lǐng)域。

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項(xiàng)目名稱：應(yīng)用ATP發(fā)光法的日化產(chǎn)品抗菌抑菌檢測(cè)方法研究

項(xiàng)目編號(hào)：KJ2014004

作者簡(jiǎn)介：

邱皓璞 1989.5 男 江蘇南京 助理工程師 學(xué)士學(xué)位，研究方向：食品相關(guān)產(chǎn)品