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    鴨瘟病毒感染的診斷與病毒分離鑒定

    2018-06-11 08:42:44李小倫
    中國動物保健 2018年1期
    關鍵詞:鴨場尿囊病鴨

    李小倫

    鴨瘟( Duck plague,DP)俗稱“大頭瘟”,又名鴨病毒性腸炎( Duck viral enteritis, DVE),是由鴨瘟病毒( Duck plague virus,DPV)引起的一種急性、敗血性及高度致死性的傳染病。本病的特征是體溫升高,病鴨腫頭流淚,下痢,食道黏膜出血或壞死,兩腿麻痹,排出綠色稀糞,剖檢特征可見心臟表面有針尖大小的出血點,肝臟腫大明顯,呈土黃色,質脆,肝臟表面有針尖大灰色壞死灶和出血點,膽囊腫大,脾腫大,肺充血、出血和壞死,咽喉部有黏液、氣管內有少量漿液性分泌物。本病流行廣泛,該病一旦發(fā)生,傳播迅速,發(fā)病率和死亡率高,能夠造成非常大的經(jīng)濟損失,是危害養(yǎng)鴨業(yè)的最主要疫病之一。加強鴨瘟病毒診斷對預防和控制本病都具有重要的現(xiàn)實意義,本文通過對養(yǎng)殖場發(fā)生的一例鴨瘟病毒感染的診治,以期為廣大養(yǎng)殖戶提供參考,現(xiàn)將整個診治過程介紹如下。

    1材料和方法

    1.1主要試劑與試劑盒

    pMD18-T克隆載體購自寶生物(大連)有限公司;病毒基因組提取試劑盒、膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒購自北京百泰克生物科技有限公司。

    1.2臨床診斷

    1.2.1臨床癥狀 觀察發(fā)病鴨的臨床癥狀。

    1.2.2病理變化對病死鴨解剖,觀察病理變化。

    1.3實驗室PCR檢測

    1.3.1病料樣品的處理無菌采集病鴨的病變組織,研磨后反復凍融3次,離心取上清液即得處理后的病料樣品。1.3.2引物設計與合成根據(jù)參考文獻合成1對鴨瘟特異性檢測引物(上游引物P1:5-CGACTACA TCCA TACC CACT-3;下游引物P2:5- TATGCTTC AGCT ACAC TA-3,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

    1.3.3 PCR擴增取處理后的病料樣品0.2mL,利用病毒基因組提取試劑盒提取DNA后進行PCR擴增,PCR擴增程序為:95℃5min;95℃30s, 47℃30s, 72℃45s,35個循環(huán);72℃10min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。

    1.4病毒分離與鑒定

    1.4.1病毒的增殖取處理后的病料樣品2.OmL經(jīng)0.45 ym濾器過濾除菌后,絨毛尿囊膜途徑接種10日齡鴨胚10枚,120h后收集含痘斑的鴨胚尿囊膜和鴨胚尿囊液,經(jīng)鴨胚尿囊膜剪碎并用尿囊液制成懸液,12000r/min離心15min,取上清液,-20℃保存。

    1.4.2分離毒株PCR鑒定取保存的病毒液0.2mL,按照1.3.3的方法進行PCR擴增與檢測。

    1.4.3核酸序列測定PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收純化,連接至pMD18-T克隆載體,質粒提取試劑盒提取重組質粒,送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

    2結果與分析

    2.1發(fā)病鴨臨床癥狀

    病鴨初期表現(xiàn)精神沉郁,食欲不振,之后排黃綠色稀便,眼瞼水腫,頭部腫大,雙翅下垂,兩腿麻痹,不愿走動,發(fā)病3~5d死亡。

    2.2發(fā)病鴨病理剖檢

    剖檢可見鴨肝表面以及切面有大小不等的灰白色壞死點及小出血點,喉頭及氣管黏膜充血,咽喉部及氣管有黏液性分泌物,腺胃、肌胃、脾臟和腎臟呈出血性壞死,肺臟出血水腫,頭頸部皮下組織膠樣浸潤。2.3病料PCR檢測

    PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳,在位于510bp處可見特異性DNA擴增條帶,與預期大小相符。

    2.4病毒增殖

    鴨胚接種后96—120h死亡,鴨胚全身有點狀出血和水腫,鴨胚尿囊膜增厚,出現(xiàn)白色痘斑。

    2.5孩酸序列測定

    測序結果經(jīng)過Blast序列比對,表明插入到pMD18-T載體的基因片段的核苷酸序列為鴨瘟病毒的特異性序列,通過分子生物學手段進一步證明該鴨場發(fā)生了鴨瘟病毒感染,為發(fā)病鴨場的疾病防控提供有力的技術保障。

    3討論

    鴨瘟是一種傳染性強、死亡率高的疾病,潛伏期一般為3~7d,感染鴨表現(xiàn)出精神不振,頭頸部會成縮起的狀態(tài),病鴨喜歡獨處,并比較喜歡飲水,發(fā)病初期會表現(xiàn)厭食和消瘦,眼瞼腫脹,在出現(xiàn)癥狀后的3~ 5d內就會死亡,鴨瘟的早期癥狀有利于及時的發(fā)現(xiàn)并采取防控措施。本文通過對發(fā)病鴨場疑似鴨瘟癥狀的病鴨進行臨床和實驗室診斷,最終通過PCR檢測、病毒分離和測序鑒定確定該鴨場發(fā)生了鴨瘟疫情,為發(fā)病鴨場找到了致病原,對有效控制該病的發(fā)生及傳播具有重要意義。鴨場發(fā)生鴨瘟病毒感染后,要加強鴨群的日常飼養(yǎng)管理,加強免疫抑制病的防控,防止鴨瘟與其它細菌病和病毒病的繼發(fā)感染,加強飼料的營養(yǎng),提高鴨群的整體免疫力,注意鴨舍內的通風,減少各類不良應激的發(fā)生,為防控鴨瘟的發(fā)生大有裨益。鴨瘟病毒感染一般呈零星發(fā)病,規(guī)模養(yǎng)殖場做好鴨瘟的免疫接種一般不會發(fā)生大規(guī)模的暴發(fā)和流行,由于鴨瘟活疫苗的免疫周期短,免疫效果不夠持久,所以建議規(guī)?;唸隹梢愿鶕?jù)鴨體內的抗體監(jiān)測水平進行免疫,鴨瘟高發(fā)地區(qū)可以聯(lián)合應用活苗和滅活疫苗。根據(jù)鴨瘟的傳染特點,發(fā)病初期要切斷傳染源,一旦發(fā)生鴨瘟疫情要及早隔離發(fā)病鴨,防止鴨瘟病毒擴散傳播,注射相應的血清,這是最好的對癥療法。同時可選擇用抗生素、抗病毒類藥物和清熱解毒類中藥劑等進行輔助治療,可有效降低感染后的死亡率。

    參考文獻:

    [1]莊金秋,梅建國,王艷,等鴨瘟病毒實驗室檢測方法研究進展[J]水禽世界,2015(2):38-43

    [2]單建平鴨瘟的臨床癥狀及防治措施[J]畜牧獸醫(yī)科技信息,2016(9):111

    [3]陳金龍鴨瘟的診斷與防治措施[J]現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2016(11):308

    [4]于新友,李天芝,劉吉山,等鴨瘟病毒PCR快速檢測方法的建立及應用[J]養(yǎng)禽與禽病防治,2015(2):42-44

    [5]崔楊,李一經(jīng)鴨瘟的病原、臨床表現(xiàn)與防控措施[J]現(xiàn)代畜牧科技,2016(4):94

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