PEI-SPIO包裹的siRNA在小鼠肝癌存留時間的研究

楊 針，張文智，盧 鵬

(解放軍總醫(yī)院海南醫(yī)院肝膽外科，海南三亞 572000)

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一[1-3]，多數患者在得到確診時已發(fā)展至晚期，失去了手術或其他根治性治療的機會，而對于晚期肝癌患者的治療效果仍未能令人滿意。小干擾RNA(siRNA)在腫瘤基因靶向治療中已成為研究熱點，成為有希望的治療策略[4-5]。siRNA是指具有特定長度和結構的RNA，由雙鏈RNA被核酸內切酶切割而成[5-6]，主要通過互補序列的mRNA降解來調節(jié)基因的表達，在進化中高度保守，具有特異性、簡單性及穩(wěn)定性[7]。然而，siRNA在實際應用中存在著“脫靶”效應[8]、半衰期短、細胞攝取率低等問題，從而限制了其在抗腫瘤治療中的應用。聚乙烯亞胺(PEI)是一種人工合成的陽離子納米基因載體，廣泛應用于質粒、核苷酸的傳輸[9]。PEI通過氨基上的正電荷與磁性納米顆粒(SPIO)的羧基、siRNA磷酸基上的負電荷結合，再通過“質子海綿效應”將siRNA釋放進而發(fā)揮RNA干擾作用[10]。有研究表明，聚乙烯亞胺修飾的磁性納米顆粒(PEI-SPIO)與siRNA結合后能有效保護其不被核酸酶降解[11]，順利穿過細胞膜進入細胞中，從而發(fā)揮RNA干擾作用[12]。如何將醫(yī)用納米技術應用在肝臟腫瘤的靶向治療已成為研究的熱點。本研究通過構建帶有熒光素酶的C57BL/6小鼠原位肝癌模型，再將PEI-SPIO包裹的siRNA注入小鼠體內，進一步測試PEI-SPIO包裹的siRNA在C57BL/6小鼠原位肝癌中的攝取及siRNA在小鼠腫瘤滯留時間，從而為進一步研究PEI-SPIO包裹的siRNA在抑制小鼠肝癌生長的作用提供基礎，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

20只雌性C57BL/6小鼠，8周齡，體重20 g左右(購于空軍軍醫(yī)大學動物中心)，飼養(yǎng)于空軍軍醫(yī)大學醫(yī)學實驗動物中心，所有操作均符合空軍軍醫(yī)大學科研倫理要求(審批號：XJYYLL-2014051)。小鼠肝癌luc-hepa1-6細胞系由本院實驗室凍存。PEI-SPIO由空軍軍醫(yī)大學藥學系實驗室合成，Cy5熒光標記的siRNA(Cy5-siRNA)由廣州銳博公司合成。Matrigel基質膠購于美國Discovery Labware公司，細胞計數儀、小動物活體成像儀購于美國Caliper life science公司，微量進樣器、D-Luciferin購于美國Goldbio公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)

luc-hepa1-6細胞完全培養(yǎng)基為15%胎牛血清的DMEM，細胞置于37 ℃的CO2孵箱中進行培養(yǎng)。

1.2.2luc-hepa1-6細胞膠懸液制備

將luc-hepa1-6細胞用胰酶消化，離心，細胞計數儀計數，最后用Matrigel基質膠稀釋成8×107/mL的膠懸液。用微量進樣器吸取膠懸液，放置于冰上防止其凝固。

1.2.3C57BL/6小鼠原位肝癌模型構建

用戊巴比妥鈉對小鼠進行腹腔注射麻醉。將小鼠仰臥位固定于鼠板，以75%乙醇常規(guī)消毒，于下腹部正中線切開腹部皮膚，依次剪開皮膚、腹膜，由下向上至劍突下，充分暴露肝臟，將微量進樣器刺入肝葉內約l cm，緩慢推注25 μL含有2×106個luc-hepa1-6細胞的Matrigel基質膠膠懸液，緩慢拔出微量進樣器。逐層縫合關腹，再次乙醇消毒。

1.2.4活體監(jiān)測小鼠體內成瘤情況

在小鼠接種原位肝癌第20天按10 μL/g體重濃度，加入相應體積的30 mg/mL D-Luciferin對小鼠進行腹腔注射。注射入體內15 min后，通過吸入2%異氟烷實施麻醉且在整個顯像過程中持續(xù)吸入，將小鼠仰臥位擺放于LuminaⅡ活體成像系統的暗箱中，進行原位肝癌的活體成像。

1.2.5活體檢測siRNA在小鼠體內的分布

在接種原位瘤后的第21天，通過尾靜脈注射PEI-SPIO包裹的siRNA。先將PEI-SPIO在超聲儀中超聲1 h，然后將PEI-SPIO與Cy5-siRNA(siRNA的量按照與小鼠的體重比為0.5 g/kg)按照一定的比例復合，使其總體積達到400 μL，室溫孵育30 min。將C57BL/6荷瘤小鼠固定在小鼠固定器中，尾靜脈注射Cy5-siRNA或孵育好的PEI-SPIO與Cy5-siRNA的復合物。分別在注射后2、8、24 h用LuminaⅡ活體成像系統選擇激發(fā)光波長在640 nm檢測Cy5標記的siRNA在小鼠體內的分布情況。

1.2.6原位肝癌的病理檢測

成像結束后，腹腔注射戊巴比妥麻醉，待麻醉后固定在小鼠版上，從心尖灌注生理鹽水，灌注后留取肝臟、腎臟、脾臟等組織。經10%的甲醛固定液固定24～48 h，制備石蠟切片，蘇木素-伊紅(HE)染色進行常規(guī)染色檢查。同時切片進行普魯士藍染色，檢測PEI-SPIO在原位肝癌中的分布。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 C57BL/6小鼠原位肝癌模型

在小鼠肝原左葉接種2×106個luc-hepa1-6細胞，接種后第21天用小動物活體成像系統檢測小鼠原位肝癌的成瘤情況，結果顯示luc-hepa1-6細胞系可在小鼠肝臟種植成瘤，見圖1。

圖1 小鼠接種后第21天原位肝癌的熒光圖

2.2 活體檢測siRNA在小鼠體內的分布

Cy5-siRNA和PEI-SPIO與Cy5-siRNA的復合物主要在肝臟、腎臟聚集。Cy5-siRNA于2 h在肝臟聚集達到高峰，很快轉移至腎臟，8 h后可見熒光值開始降低，24 h肝臟部位熒光強度明顯降低。而PEI-SPIO與Cy5-siRNA的復合物可在肝癌部位持續(xù)存在，24 h后仍可見到Cy5-siRNA的熒光值處于非常高的水平，見圖2。

A.不同時間點Cy5-siRNA在小鼠肝臟腫瘤的熒光分布圖；B.小鼠肝臟腫瘤Cy5-siRNA熒光值的統計分析圖；a：P<0.05。

2.3 肝癌大體標本和病理學切片

小鼠灌注取材結果顯示，腫瘤在小鼠肝臟左葉，其形態(tài)不規(guī)則呈結節(jié)狀浸潤生長，表明凹凸不平，質地較硬，見圖3。病理切片HE染色結果顯示，肝癌組織內的細胞為類圓形或不規(guī)則形細胞異型性明顯，核質比明顯失調，呈塊狀或團塊狀分布，見圖4。

圖3 接種后第21天后小鼠原位肝癌大體標本圖

圖4 小鼠原位肝癌病理圖(HE，200×)

2.4 普魯士藍染色

切片普魯士藍染色鏡下明顯可見肝癌組織中SPIO的藍色顆粒，證實PEI-SPIO在肝癌中聚集，并能攜帶siRNA到腫瘤組織中，見圖5。

圖5 小鼠原位肝癌普魯士藍染色結果(400×)

3 討 論

近年來，siRNA被廣泛應用于腫瘤的治療之中，siRNA選擇性地與mRNA的特異性序列結合從而持續(xù)抑制致病性蛋白的表達[13-14]，發(fā)揮其抑制腫瘤生長。醫(yī)用納米技術應用于肝癌的治療中，已成為研究的熱點，其為肝癌腫瘤的靶向治療提供了新的研究方向[15-16]。本研究將納米材料PEI-SPIO與siRNA結合，檢驗PEI-SPIO包裹的siRNA在小鼠原位肝癌的持續(xù)時間，為后續(xù)研究奠定基礎。hepa1-6細胞是來源于C57小鼠的BW7756肝癌細胞系，所以，luc-hepa1-6細胞構建的小鼠原位肝癌模型在組織學上與人的肝癌高度相似，能夠為本研究肝癌的發(fā)病機制、藥物療效評價及治療方法提供動物模型。DUAN等[12]通過PEI-SPIO包裹的siRNA來治療關節(jié)炎，結果發(fā)現相比于對照組，PEI-SPIO包裹的siRNA組能明顯延長siRNA在小鼠體內的半衰期。因此，本課題組將PEI-SPIO與siRNA結合來驗證PEI-SPIO在小鼠肝癌組織中保護siRNA的能力及延長其半衰期，從而為醫(yī)用納米技術應用于肝癌的治療提供了新的方法。

本研究首先通過luc-hepa1-6細胞在C57BL/6小鼠肝左葉建立小鼠原位肝癌模型，在建立模型過程中選擇肝左葉是因為小鼠肝左葉體積相對于其他肝葉大，能夠容納25 μL體積的細胞膠懸液。在小鼠接種原位肝癌后的第21天通過尾靜脈注射Cy5-siRNA或PEI-SPIO與Cy5-siRNA的復合物，分別在注射后的2、8、24 h監(jiān)測siRNA在小鼠體內的分布，結果發(fā)現Cy5-siRNA在小鼠肝癌中2 h到達高峰，8 h后可見siRNA的熒光值開始降低，24 h后不能見到siRNA的熒光值，而PEI-SPIO與Cy5-siRNA的復合物可在肝癌中持續(xù)存在，24 h仍可在腫瘤部位見到Cy5-siRNA聚集，說明PEI-SPIO包裹的siRNA能明顯延長siRNA在小鼠肝癌組織中的半衰期。進一步灌注取材后可見肝左葉腫瘤組織，腫瘤病理切片證實為腫瘤細胞，同時可在腫瘤組織的普魯士藍染色中見到PEI-SPIO，證明SPIO能夠攜帶siRNA進入腫瘤組織中，為進一步發(fā)揮siRNA干擾抑制的作用提供載體。

綜上所述，通過將小鼠原位肝癌模型與PEI-SPIO包裹的siRNA結合建立的模型，為研究肝癌的治療提供了新的思路，同時也為醫(yī)用納米材料對腫瘤的治療提供了新的手段。PEI-SPIO包裹的siRNA能夠到達小鼠原位肝癌部位，并在腫瘤組織中持續(xù)存在一定時間。因此，今后有望通過PEI-SPIO包裹的siRNA實現針對肝癌的基因治療，提高肝癌的總體治療效果。