影響甘啤5號大麥幼胚愈傷組織誘導及植株再生的 因素研究

張正英 李靜雯

摘要：以幼胚為外植體，觀察激素、培養(yǎng)基等對甘啤5號啤酒大麥出愈率、分化率及綠苗率的影響。結果表明，在愈傷誘導過程中，誘導培養(yǎng)基CIM2（MS+1.25 mg/L CuSO4+1.00 mg/L VB1+250.00 mg/L肌醇+690.00 mg/L脯氨酸+1 g/L 水解酪蛋白+187.50 mg/L谷氨酰胺+25.00 mg/L天門冬酰胺+2.00 mg/L 2，4-D+0.50 mg/L dicamba）出愈率最高（88.4%），CIM1（MS+1.25 mg/L CuSO4+1.00 mg/L VB1+250.00 mg/L肌醇+690.00 mg/L脯氨酸+1 g/L水解酪蛋白+2.50 mg/L dicamba）與CIM2上形成的愈傷質(zhì)量優(yōu)于CIM3（MS+1.25 mg/L CuSO4+1.00 mg/L VB1+250.00 mg/L 肌醇+690.00 mg/L 脯氨酸+1 g/L水解酪蛋白+3.00 mg/L 2，4-D）；相同培養(yǎng)基中，dicamba對甘啤5號的出愈率的作用優(yōu)于2，4-D。不同分化培養(yǎng)基的分化效率不同，DCM1的分化率高（45.8%），優(yōu)于DCM2。甘啤5號的幼胚愈傷組織誘導頻率及綠苗分化率均較高，可作為啤酒大麥遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料。

關鍵詞：甘啤5號；啤酒大麥；幼胚；愈傷誘導；植株再生

中圖分類號：S512.3 文獻標志碼：A 文章編號：1001-1463（2018）10-0005-05

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2018.10.003

Effect of Combined Application of Fertilizers on Yield and Water Use Efficiency of Brassica campestris

ZHAO Zhongliang 1， LUO Zhaoxia 1， E Shengzhe 2， YANG Zhiqi 1

（1. Tianshui Institute of Agricultural Sciences， Tianshui Gansu 741000，China； 2. Institute of Soil Fertilizer and Water-saving Agriculture， Gansu Acadamy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract：With Brassica campestris cultivar Tianyou 8 as indicators， the combination ratios of organic fertilizer and nitrogen， phosphorus and potassium fertilizer on Yield and water use efficiency of Brassica campestris were studied. The results show that fertilization can obviously improve the yield and water use efficiency of Brassica campestris， and the effect of combined application of organic fertilizer and nitrogen， phosphate and potassium fertilizer is more significant. Under the treatment of chicken manure 7 500 kg/hm2（dry weight）， urea 150 kg/hm2， ordinary superphosphate 75 kg/hm2， potassium sulphate 75 kg/hm2， the winter survival rate of Brassica campestris is 98.56%， 9.37% higher than the control； the yield is 2 575.04 kg/hm2， 550.00% higher than that of the control； and the water use efficiency is 5.80 kg /（hm2·mm）， 504.17% higher than the control. The yield and water use efficiency of all treatments with organic fertilizer are better than non-organic fertilizer， indicating that combined application of organic manure and NPK fertilizer is the best choice to improve the yield and water use efficiency of Brassica campestris.

Key words：Brassica campestris；Combined application；Yield；Water use efficiency；Winter survival rate

大麥是世界上主要的糧食、釀酒原料和飼料作物[1 ]。利用轉(zhuǎn)基因和基因編輯等現(xiàn)代生物技術將成為優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)專用大麥新品種培育的有效途徑，而建立高效的組織培養(yǎng)再生體系是其重要的基礎工作。大麥是開展遺傳轉(zhuǎn)化較早的單子葉作物，已有研究表明，基因型是影響大麥組培再生的重要因素，不同基因型再生能力差異很大，大部分品種難以通過組織培養(yǎng)獲得再生植株[2 ]；外植體的不同對大麥再生能力也有很大影響。國內(nèi)外相繼開展了通過幼胚、成熟胚、幼穗或頂端分生組織等不同外植體建立大麥植株再生體系的研究，結果表明，幼胚具有較好的培養(yǎng)再生能力，是建立大麥遺傳轉(zhuǎn)化體系最適宜的外植體；成熟胚作為外植體具有取材方便、數(shù)量大、保存期長等優(yōu)點，能極大地方便轉(zhuǎn)基因技術的應用，以成熟胚為外植體建立高效的再生體系的研究受到重視。

以幼胚和成熟胚為外植體的植株再生體系因受基因型和激素類型等的影響，存在著誘導分化率低等諸多問題，目前多數(shù)大麥轉(zhuǎn)基因工作只能在一些模式品種上進行，而這些模式品種已不再是生產(chǎn)中的主推品種，甚至不是理想的親本材料，極大地限制了轉(zhuǎn)基因技術在大麥育種上的應用效果。甘啤5號是甘肅省農(nóng)業(yè)科學院選育的二棱皮大麥啤酒釀制專用品種，具有早熟、抗倒伏、抗干旱、耐鹽堿、抗干熱風和抗條紋病等優(yōu)良性狀，種皮薄、粒徑大、千粒重高、發(fā)芽勢強，屬優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)廣適性啤酒大麥品種，有良好的推廣應用前景，在甘肅、云南等省區(qū)種植面積較大[3 - 7 ]。我們對影響甘啤5號幼胚和成熟胚愈傷組織誘導及植株再生培養(yǎng)的影響因素進行了研究，試圖建立適宜甘啤5號特定基因型的高效再生體系，為啤酒大麥遺傳轉(zhuǎn)化和品質(zhì)改良等分子育種研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試大麥品種為甘啤5號、Golden promise、Schooner ，其中甘啤5號種子由甘肅省農(nóng)業(yè)科學院啤酒大麥育種課題組提供，Golden promise、Schooner由英國JIC提供。

1.2 培養(yǎng)基

試驗所用培養(yǎng)基共4類，即愈傷誘導培養(yǎng)基（CIM）、繼代培養(yǎng)基（CSM）、分化培養(yǎng)基（DCM）和生根培養(yǎng)基（RCM）。各種培養(yǎng)基成分見表1。所有培養(yǎng)基加入30 g/L麥芽糖和4.2 g/L瓊脂粉，調(diào)pH至5.8，于121 ℃、0.1 MPa壓力下高壓蒸汽滅菌20 min。

1.3 試驗方法

大麥種子播種于大田，密切觀察生長發(fā)育情況，開花后12～14 d從田間采幼穗剝?nèi)∮着?。其他田間管理與一般大田相同。

1.4 取材及組織培養(yǎng)方法

1.4.1 取材及滅菌 大麥開花后12～14 d（幼胚長約1.0～1.5 mm）時剪下幼穗，剝出籽粒，用70%的酒精表面消毒1 min，再用0.1% 的升汞（HgCl2）消毒8 min，無菌水沖洗3～4次。

1.4.2 幼胚處理及脫分化培養(yǎng) 在超凈工作上用鑷子剝?nèi)∮着撸瑒內(nèi)ヅ咻S后盾片朝上接種于3種愈傷組織誘導培養(yǎng)基，每個直徑9 cm的培養(yǎng)皿接入40～50枚幼胚，3次重復，在25 ℃下暗培養(yǎng)。

1.4.3 愈傷組織的繼代與分化培養(yǎng) 將出愈的愈傷組織轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基上，每14 d繼代1次，培養(yǎng)條件同上。將誘導出的愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基DCM 1或DCM 2上，在人工培養(yǎng)箱中于24 ℃、3 000 lx白光下，12 h光照、12 h黑暗培養(yǎng)。

1.4.4 再生苗的生根培養(yǎng)及移栽 分化再生苗長至2～3 cm時，將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，在25 ℃光培養(yǎng)4～5 d。待生成新根，試管苗長出3葉1心后，室內(nèi)打開瓶口，煉苗2～3 d。沖洗干凈根部的培養(yǎng)基，將苗移栽到裝有營養(yǎng)土（蛭石與大田土按質(zhì)量比1∶1配制）的營養(yǎng)缽中。長出1片心葉后帶基質(zhì)移栽至大田。

1.5 統(tǒng)計與分析

幼胚接種于愈傷組織誘導培養(yǎng)基21 d后，統(tǒng)計不同品種的愈傷組織誘導率，并以愈傷組織的大小和表觀（色澤，緊實度以及胚性區(qū)域比例）來判斷其質(zhì)量。良好的愈傷組織色澤光亮，淡黃，爽脆，質(zhì)地緊密，表面有瘤狀突起。分化培養(yǎng)28 d后，統(tǒng)計綠苗分化率。

出愈率=（誘導出愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)）×100%

綠苗率=（分化出綠苗數(shù)/接種的愈傷組織數(shù)）×100%

2 結果與分析

2.1 激素對幼胚愈傷組織誘導的影響

高的愈傷組織誘導率是大麥植株再生的必要前提，不同激素種類對不同大麥基因型幼胚愈傷組織誘導效果不同。通過表2可以看出，甘啤5號在3種誘導培養(yǎng)基上均能形成愈傷組織，但誘導率有明顯差異，愈傷組織質(zhì)量也不同。甘啤5號在誘導培養(yǎng)基CIM1和CIM2上形成的愈傷組織顏色淡黃、質(zhì)地緊密，顆粒狀的胚性愈傷多，且生長較快，說明dicamba對甘啤5號愈傷組織的形成有顯著的正效應，其效果優(yōu)于2，4-D。不同激素培養(yǎng)基對甘啤5號的誘導效果由大到小依次為dicamba+2，4-D（88.36%）、dicamba（49.31%）、2，4-D（35.19%）。同時也表明，已知培養(yǎng)特性良好的大麥基因型Golden promise和Schooner無論在2，4-D或dicamba單獨或者聯(lián)用的情況下均表現(xiàn)出很高的愈傷組織誘導率，且差異不明顯。同時發(fā)現(xiàn)，dicamba對愈傷組織的質(zhì)量有明顯影響，形成的愈傷組織色澤光亮，質(zhì)地緊密，顆粒狀的胚性愈傷多。

2.2 基因型對幼胚愈傷組織誘導的影響

從表3可以看出，甘啤5號的出愈率為57%左右，明顯低于Golden Promise、Schooner 97%以上的出愈率，3個品種之間的幼胚愈傷組織誘導效果相差很大，再一次證實愈傷組織的誘導是由基因控制的可遺傳性狀。甘啤5號的幼胚愈傷組織誘導效果雖然低于Golden Promise和Schooner，但出愈率也達到了50%以上，也表現(xiàn)出較好的培養(yǎng)特性，可以應用于一般遺傳轉(zhuǎn)化試驗。

2.3 基因型對幼胚愈傷組織分化的影響

將幼胚愈傷轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基14 d后，一些淡黃色的愈傷組織表面漸漸長出綠原基，其中一部分能繼續(xù)分化形成綠苗，生長發(fā)育成植株；而另一些則只能生根，難以繼續(xù)分化成苗。不同大麥基因型分化能力不同（圖1），Golden Promise與甘啤5號在DCM1上的分化率分別為93.6%與45.8%，Golden promise的分化率明顯高于甘啤5號，可見大麥幼胚誘導的愈傷組織分化成苗具有較強的品種特異性。Golden Promise在DCM1、DCM2不同分化培養(yǎng)基上的分化率差異不大。甘啤5號、Schooner 2個品種在DCM1上的分化率明顯高于DCM2，說明除基因型對植株再生起重要作用外，分化培養(yǎng)基中添加不同激素也對植株再生產(chǎn)生重要影響。

2.4 生根培養(yǎng)及移栽

3種基因型在不同分化培養(yǎng)基上得到的再生苗生長情況基本一致，在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)都能產(chǎn)生根系，煉苗移栽后生長差異不大。

3 小結與討論

本研究表明，基因型無論在幼胚愈傷組織的誘導培養(yǎng)還是幼胚愈傷組織的分化培養(yǎng)中起著主導作用，不同基因型的誘導率與分化率相差很大，同一基因型的誘導培養(yǎng)與分化培養(yǎng)表現(xiàn)也并不總是一致。在脫分化培養(yǎng)中，Golden Promise和Schooner的愈傷組織誘導率均很高，對不同激素培養(yǎng)基的反應差別不大。而甘啤5號愈傷組織誘導率低于Golden Promise和Schooner的誘導率，且dicamba的誘導效果明顯優(yōu)于2，4-D的誘導效果。在愈傷組織分化培養(yǎng)中，3個基因型在分化培養(yǎng)基上的反應基本一致，即在同時加入6-芐基腺嘌呤和萘乙酸的培養(yǎng)基的分化培養(yǎng)效果優(yōu)于在只加入6-芐基腺嘌呤的培養(yǎng)基上的效果。但Golden Promise依然保持了良好的分化培養(yǎng)特性，而Schooner的表現(xiàn)甚至不如甘啤5號。從總體結果來看，甘啤5號在脫分化培養(yǎng)和愈傷組織分化培養(yǎng)中表現(xiàn)出較好的培養(yǎng)特性，說明本試驗設計的愈傷組織誘導培養(yǎng)基和愈傷組織分化培養(yǎng)基適合甘啤5號的培養(yǎng)，對以甘啤5號幼胚為外植體的遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立奠定了基礎。

dicamba是禾谷類作物愈傷組織誘導培養(yǎng)基中使用較為廣泛的一種激素。Castillo等[8 ]的研究表明，相對2，4-D而言，dicamba利于胚性愈傷組織的誘導和維持以及提高愈傷組織分化潛能。本研究同樣表明dicamba對大麥愈傷組織的誘導效果優(yōu)于2，4-D，盡管不同基因型的反應有所不同。

在Dahleen[9 ]和李會勇等[10 ]研究表明，在誘導培養(yǎng)基中提高Cu2+濃度明顯提高出愈率和再生率，對啤酒大麥胚性愈傷組織的形成有明顯的促進作用。一些關于小麥組織培養(yǎng)的研究同樣表明提高Cu2+濃度明顯提高綠苗再生率。Purnhauser[11 ]在6種不同Cu2+含量的培養(yǎng)基中進行了再生試驗，結果表明在培養(yǎng)基中增加Cu2+含量，植株再生率最高可提高8倍；Purnhauser等[12 ]研究表明，CuSO4顯著地增強了小麥分化綠苗的能力，還能刺激根系的形成；AgNO3雖能促進綠苗分化，卻抑制了小麥根系的形成。

Nuutila等[13 ]研究表明，胚性愈傷組織形成的早期對有機氮的要求較高，這很可能與水解酪蛋白、脯氨酸、谷氨酰胺等能夠顯著增加胚性細胞生成比例有關，氮的組成和Cu2+濃度對大麥再生效率的影響是明顯的，通過優(yōu)化這些因素能夠改進大麥的再生效率和降低白化苗比例。邢莉萍 等[14 ]在小麥幼胚培養(yǎng)中添加水解酪蛋白、谷氨酰胺等，獲得良好的培養(yǎng)效果。本試驗在幼胚愈傷組織誘導培養(yǎng)基中增加了CuSO4用量，添加了谷氨酰胺和天門冬酰胺，發(fā)現(xiàn)愈傷組織的誘導率明顯較高，且形成的胚性愈傷組織也較多，明顯提高了綠苗分化率?？傊?，本研究證明甘啤5號幼胚愈傷組織出愈率及分化率都較高，可作為大麥遺傳轉(zhuǎn)化的受體。

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（本文責編：陳 偉）