甘草提取物對甘草內(nèi)生真菌G11的生長及產(chǎn)甘草酸能力的影響

張敏敏　張運暉　趙瑛

摘要：將產(chǎn)甘草酸的甘草內(nèi)生真菌G11在甘草提取物中培養(yǎng)，觀察了其生長及次級代謝產(chǎn)物。結(jié)果表明，在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入2.0%甘草提取液可提高菌株產(chǎn)甘草酸的能力；在固體培養(yǎng)基中加入3.0%甘草提取液時，該菌株菌絲體長勢最好，生長速度最快。

關(guān)鍵詞：甘草；內(nèi)生真菌；甘草酸；能力

中圖分類號：S565.4 文獻標志碼：A 文章編號：1001-1463（2018）11-0021-03

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2018.11.007

Influence of the Licorice Extracts on Growth and Ability to Produce Glycyrrhizic Acid of Acid-producing Endophytic Fungus G11

ZHANG Minmin， ZHANG Yunhui， ZHAO Ying

（Institute of Biotechnology， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China ）

Abstract：In this experiment，the Glycyrrhizic Acid-producing Endophytic Fungus G11 was cultured in Glycyrrhiza extract and its growth and secondary metabolites were observed. The result showed that the yield of Glycyrrhizic acid were effectively improved by adding 2% licorice plant extract into the fermentation medium； The hypha grew best and had the fastest growth rate when 3.0% liquorice extract was added to the solid medium.

Key words：Licorice； Endophytic fungus； Glycyrrhizic acid； Ability

甘草酸（Glycyrrhizic Acid）是五環(huán)三萜皂甙化合物，是甘草的主要藥用有效成分之一，具有抗炎[1 - 2 ]、抗菌[3 ]、抗氧化[4 ]、抗腫瘤[5 - 6 ]、抗病毒等活性[7 - 8 ]，現(xiàn)已被廣泛地應用于藥品、食品等領域[9 ]。目前甘草酸主要是從甘草的根部提取，致使野生甘草成為漸危植物，而人工種植甘草周期長，組織培養(yǎng)技術(shù)也不成熟。1993年Stierle A 等[10 ]首次報道從紫杉樹中分離出一種可產(chǎn)生紫杉醇的內(nèi)生真菌，之后又有眾多研究者在多種植物中分離到能產(chǎn)生與宿主相同或相似生理活性代謝產(chǎn)物的內(nèi)生菌，于是篩選和利用內(nèi)生菌生產(chǎn)藥物有效成分成為一種藥物開發(fā)的新途徑。我們將分離出的1株產(chǎn)甘草酸的甘草內(nèi)生真菌在甘草提取液中培養(yǎng)，以探究菌株生長及產(chǎn)甘草酸能力。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 甘草樣品 采集于甘肅省定西市渭源縣會川鎮(zhèn)半陰坡村，為完整植株，隨機選取根部裝入滅菌紙袋內(nèi)編號備用。

1.1.2 供試菌株 產(chǎn)甘草酸內(nèi)生真菌菌株G11由甘肅省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所分離并保藏。

1.1.3 試劑及儀器 主要有馬鈴薯固體培養(yǎng)基、馬鈴薯液體培養(yǎng)基、甘草酸標準品（購于北京索萊寶科技有限公司，純度≥98%）及BS210S分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）、生化培養(yǎng)箱LRH-250F（上海齊欣科學儀器有限公司）、雙層恒溫培養(yǎng)振蕩器ZHWY-2102C（上海智城分析儀器制造有限公司）、高速離心機Centrifuge5810R（德國eppendorf公司）、紫外分光光度計（北京萊伯科技有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海瀘西分析儀器廠）、超凈工作臺SW-CJ（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 甘草根的處理 將新鮮甘草根用清水洗凈，無菌水沖洗2～3次，75%酒精漂洗5 min，無菌水沖洗4次后用0.1%升汞溶液消毒8 min，最后用無菌水沖洗5次。用無菌刀片將消過毒的根部切成0.5～1.0 cm的小段。

1.2.2 菌種的活化 將G11菌種在生化培養(yǎng)箱中28 ℃下活化24 h。

1.2.3 甘草提取物對內(nèi)生真菌G11生長狀態(tài)的影響 將處理過的甘草根部加到組織研磨器中，加入少量PDA液體培養(yǎng)基研磨，用針頭過濾器過濾2次，并將過濾液分別按照0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%的濃度添加到50 mL未凝固的PDA培養(yǎng)基中，重復3次，用接種鏟在長有G11的培養(yǎng)基邊緣刮下菌絲，接種到含有植物提取液的培養(yǎng)基中，在生化培養(yǎng)箱28 ℃下倒置培養(yǎng)4 d，以不加甘草提取液的PDA培養(yǎng)基為對照。觀察G11菌絲長勢和生長速度。

1.2.4 種子液的制備 從活化后的斜面中挑取G11菌種接至PDA平板，置于生化培養(yǎng)箱中28 ℃下倒置培養(yǎng)3 d，然后用接種鏟在菌落邊緣生長旺盛處刮下菌絲接種至50 mL PDA液體培養(yǎng)基中，置于轉(zhuǎn)速為120 r/min搖床上28 ℃下培養(yǎng)2 d，即得種子菌懸液。

1.2.5 甘草提取物對內(nèi)生真菌G11產(chǎn)甘草酸能力的影響 將處理過的甘草根部按1.2.1及1.2.3的方法處理并加入PDA培養(yǎng)基，分別形成含0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%植物提取液的發(fā)酵培養(yǎng)液，然后將種子液以10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)液，3次重復，置于轉(zhuǎn)速為100 r/min的搖床上 28 ℃下培養(yǎng)6 d，以不加植物提取液的發(fā)酵培養(yǎng)基為對照。發(fā)酵結(jié)束后將錐形瓶真空抽濾，分別收集濾液和菌絲體。濾液用等體積的二氯甲烷萃取 3次，合并上層有機相；菌絲體凍融后充分研磨，加入30 mL乙酸乙酯，超聲萃取15 min，有機相與前述有機相合并，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上35 ℃去除有機溶劑濃縮至干，將得到的萃取物溶于1 mL甲醇中，4 000 r/min離心10 min取上清液，用于檢測甘草酸的含量[11 - 12 ]。

精密稱取甘草酸標準品1 mg，甲醇定容至10 mL，得母液濃度為0.1 mg/mL。將母液依次稀釋成濃度梯度為2.0、1.5、1.0、0.5、0.1 mg/L的標準品，在252 nm波長處分別測定吸光度，以濃度為橫坐標，吸收度為縱坐標；計算回歸方程，繪制標準曲線，處理后的發(fā)酵液在紫外-可見分光光度計上測定其吸光度[13 ]。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘草提取物對內(nèi)生真菌G11菌落生長狀態(tài)的影響

由表1可知，添加3.0%、4.0%甘草提取物時，G11菌絲長勢最好，培養(yǎng)過程中生長速度也很快，可能是因為當提取物添加至3.0%時即可以滿足該菌株生長所需的條件。因此，要促進菌株生長，可添加3.0%的甘草提取物。

2.2 甘草提取物對內(nèi)生真菌G11產(chǎn)甘草酸能力的影響

由圖1可得回歸方程為y=0.087 8x+0.032 1，R2=0.999 1。式中y為甘草酸的吸光度，x為溶液濃度。表明溶液濃度在0.1～2.0 mg/L內(nèi)時，吸光度與甘草酸標準品的濃度呈良好的線性關(guān)系。根據(jù)發(fā)酵液提取物的吸光度，由所得回歸方程可以計算出菌種G11產(chǎn)甘草酸的能力，結(jié)果如圖2所示。

在培養(yǎng)基中添加不同濃度的甘草提取液，甘草酸的產(chǎn)量發(fā)生了不同變化，說明甘草提取液的添加對甘草酸內(nèi)生菌G11產(chǎn)甘草酸的能力有一定的影響。通過圖2可知，當甘草提取液添加至2.0%時，甘草酸含量最高；當添加至3.0%以上時，甘草酸的產(chǎn)量卻隨著濃度的增大而不斷減小。這可能是由于宿主植物中的某些成分會影響其次級代謝過程，當添加量超過正增長的范圍時，菌株的次級代謝系統(tǒng)反而會受到抑制，但此猜測還需要進一步驗證。

3 小結(jié)與討論

內(nèi)生菌與植物經(jīng)過共同的漫長進化過程，其基因中或含有與寄主植物相似的部分，使得內(nèi)生菌具有可產(chǎn)生與植物相同活性物質(zhì)的能力。本研究通過對甘草內(nèi)生真菌G11產(chǎn)甘草酸能力的分析，發(fā)現(xiàn)當植物提取液添加至3.0%時，有利于G11的生長，此時菌絲長勢最好；但當植物提取液添加至2.0%時，最有利于甘草酸的生產(chǎn)，提取液濃度繼續(xù)提高時反而會抑制甘草酸的生產(chǎn)。在本研究最終優(yōu)化的發(fā)酵條件下，甘草酸產(chǎn)量達到1.005 mg/L，但相對于植物體所產(chǎn)甘草酸的含量仍然甚微。因此，要通過甘草內(nèi)生菌生產(chǎn)甘草酸，還需要繼續(xù)篩選優(yōu)勢菌種和優(yōu)化發(fā)酵條件。

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（本文責編：陳 偉）