高等植物葉綠體表達重組蛋白研究進展

林優(yōu)紅，程霞英，楊東風，梁宗鎖，楊宗岐

浙江理工大學 生命科學學院，浙江 杭州 310018

近年來，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)日漸成熟，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)表達生產(chǎn)重要重組蛋白的研究愈發(fā)受到關(guān)注。傳統(tǒng)的重組蛋白表達系統(tǒng)主要有大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞以及昆蟲細胞等。每種表達系統(tǒng)都有各自的優(yōu)點，如大腸桿菌和酵母的遺傳背景清楚、培養(yǎng)操作簡單；昆蟲細胞可用于真核蛋白表達；哺乳動物細胞表達的重組蛋白最接近天然蛋白[1]。但仍有一些限制因素阻礙著這些表達系統(tǒng)的開發(fā)和商業(yè)化應(yīng)用，譬如生產(chǎn)重組蛋白及后期純化成本高、效率低，重組蛋白的穩(wěn)定性和安全性問題也難以保證[2]。

植物葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化和表達體系是近年發(fā)展起來的一種新的重組蛋白表達系統(tǒng)。與植物細胞核表達平臺相比具有一些明顯優(yōu)勢：1) 葉綠體基因組拷貝數(shù)多，外源基因表達效率高；2) 母系遺傳，外源基因不會隨花粉傳播而逃逸，生物環(huán)境安全性高；3) 葉綠體基因組含有多順反子結(jié)構(gòu)，多基因可共同表達；4) 葉綠體由雙層膜包裹且無蛋白外流，為重組蛋白表達提供了一個相對安全的生物環(huán)境[3]。

目前為止，高等植物遺傳轉(zhuǎn)化和表達體系已取得豐碩的研究進展和成果。2012年，F(xiàn)DA(U.S.Food and Drug Administration) 批準Protalix公司以胡蘿卜細胞生產(chǎn)的、用于治療戈謝病的ELELYSO? (Taliglucerase alfa) 藥物正式上市。這是首個用植物細胞作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)并獲得FDA認可的藥物[4]。植物葉綠體在生產(chǎn)疫苗抗原、工業(yè)酶等重要重組蛋白和生物燃料方面也取得了顯著成就，尤其是某些重組蛋白能提高植物對非生物壓力的承受力，這對植物在逆境下生長具有重要意義[5]。為使葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化與表達體系更加適應(yīng)商業(yè)化生產(chǎn)模式，基因組學、蛋白質(zhì)組學、植物細胞凍干法、核糖體圖譜和質(zhì)譜技術(shù)等多種研究手段應(yīng)用于葉綠體表達系統(tǒng)的開發(fā)研究。其中凍干植物細胞可在常溫下貯存數(shù)月而不失重組蛋白活性，簡化了發(fā)酵、提取、純化、低溫運輸、制備等工藝，有效降低了生產(chǎn)成本[6]。

煙草作為分子生物學研究的高等模式植物，1990年 Svab等[7]利用基因槍法首次在煙草葉綠體中成功轉(zhuǎn)化rrn16基因，并獲得穩(wěn)定表達。隨后，馬鈴薯[8]、番茄[9]、油菜[10]、胡蘿卜[11]、大豆[12]、生菜[13]、棉花[14]等重要高等植物也相繼成功實現(xiàn)葉綠體轉(zhuǎn)化表達外源基因[15]，但大多數(shù)葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化相關(guān)研究僅限于實驗室研究階段。因此，研究高等模式植物——煙草葉綠體的遺傳轉(zhuǎn)化并將其作為重要醫(yī)藥重組蛋白表達平臺具有廣闊的商業(yè)應(yīng)用和開發(fā)前景。煙草的生長周期短、生物量大、對生長環(huán)境要求低，組培系統(tǒng)成熟，轉(zhuǎn)化后的再生和篩選比其他植物尤其是單子葉作物相對容易[16-17]。在生物安全性方面，因煙草屬于不可食作物，以煙草葉綠體為外源基因表達系統(tǒng)可以避免對人、畜食物鏈造成污染。這些特點非常有利于轉(zhuǎn)基因煙草大規(guī)模種植和重組蛋白規(guī)?；a(chǎn)[2]。

1 葉綠體及其轉(zhuǎn)化

葉綠體是一個半自主性遺傳系統(tǒng)，有自己獨特的 DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯體系。根據(jù)內(nèi)共生學說，它是由一種異養(yǎng)原生生物吞噬藍藻后進化形成，故其在基因轉(zhuǎn)錄、翻譯等方面具有原核特性[17]。高等植物葉綠體基因組由一個大的單拷貝序列 (Large single-copy region，LSC)、一個小的單拷貝序列 (Small single-copy region，SSC) 以及被它們分隔開的兩個反向重復(fù)序列 (Inverted repeat sequence，IRs) 組成；共包含 120–135個基因，其中76個基因編碼不同的蛋白質(zhì)，剩余的基因編碼RNAs[3,18]。

葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化是將葉綠體特異性啟動子、終止子及5’-UTR和3’-UTR作為外源基因調(diào)控序列，和外源基因、選擇標記基因表達盒及葉綠體來源的同源重組片段共同構(gòu)建成表達載體，表達載體通過基因槍法或PEG法進入葉綠體后，利用同源重組和位點特異性整合將目的基因片段插入葉綠體基因組，最后通過選擇壓力和多輪篩選獲得同質(zhì)化植株，實現(xiàn)外源基因的整合和高效表達。轉(zhuǎn)化過程主要分為4個步驟：1) 構(gòu)建含有外源基因的表達載體；2) 表達載體導(dǎo)入葉綠體并整合至其基因組上；3) 篩選已達到同質(zhì)化水平的轉(zhuǎn)化植株；4) 外源基因在轉(zhuǎn)化植株葉綠體中表達[16]。

外源基因調(diào)控序列是實現(xiàn)外源基因高效表達的關(guān)鍵，使用最多的是葉綠體基因組內(nèi)源性高表達的psbA基因啟動子PpsbA和16S rRNA操縱子的啟動子Prrn。另有報道稱，Oey等在外源基因的 5’-UTR加上噬菌體 T7g10序列，重組蛋白表達量達到細胞可溶性總蛋白 (Total soluble protein，TSP) 的 70%[16,19]。

同源重組片段是來源于受體植物葉綠體基因組和葉綠體基因組部分片段同源的 DNA序列，具有物種特異性[20]。目前，大多數(shù)研究中外源基因整合位點通常選擇葉綠體基因組上的trnI/trnA、rbcL/accD、trnf M/trn G及rps7/ndhB等位點，其中trnI/trnA位點因整合效率高而成為最常用的外源基因整合位點[16,21]。整合位點的選擇不能破壞葉綠體內(nèi)源基因的結(jié)構(gòu)和表達。

葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化中最常選用的選擇標記是來自大腸桿菌Escherichia coli的aadA基因。此基因編碼的氨基糖苷-3’-腺苷酸轉(zhuǎn)移酶能使壯觀霉素失活。因壯觀霉素對葉綠體的核糖體 70S亞基具有高特異性，誘變率低，副作用少，故aadA是作為葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化選擇標記基因的最佳選擇[17]。近來也有研究報道指出細菌氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶/磷酸轉(zhuǎn)移酶具有同樣高效的篩選效率。其N端乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域和C端磷酸轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域能協(xié)同作用，具有對妥布霉素的抗性，且不自發(fā)產(chǎn)生抗性突變體[22]。

2 藥物蛋白的表達

由于煙草葉綠體表達重組蛋白具有轉(zhuǎn)化效率高、表達量高、定點整合、生物環(huán)境安全等特點，很多具有重要醫(yī)藥價值的蛋白質(zhì)，包括抗體、生長因子、酶、激素以及疫苗抗原等都在煙草葉綠體中成功表達 (表1)。

人類免疫缺陷病毒 (Human immunodeficiency virus，HIV) 是獲得性免疫缺陷綜合征 (Acquired immunodeficiency syndrome，AIDs) 的主要病原菌。目前市場上仍缺乏針對 AIDs的有效特異性疫苗。2012年，Rubio-Infante等[23]以HIV病毒膜蛋白gp120上的V3環(huán)和C4結(jié)構(gòu)域序列作為外源基因，在煙草葉綠體中成功表達C4V3抗原蛋白。ELISA免疫試驗顯示每克新鮮煙草葉片中 C4V3蛋白積累量達到25 μg；以每周4次、每次15 μg的劑量口服喂養(yǎng) BALB/c小鼠后發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生抗體反應(yīng)，CD4+T細胞發(fā)生增殖現(xiàn)象且有IFN-γ生成，證明煙草葉綠體中表達的C4V3蛋白具有免疫活性和抗原性。

表1 近年高等植物葉綠體中表達的重組蛋白Table 1 The expression of recombinant proteins in higher plant chloroplast

為了進一步增強 AIDs疫苗活性，2015年Rubio-Infante等[46]又進一步構(gòu)建和表達了嵌合式、含多個免疫表位的抗原蛋白Multi-HIV。多個免疫表位分別來自幾種HIV株系的gp120和gp41膜蛋白，具有針對不同B細胞和T細胞的功能。研究者用從煙草葉綠體中提取的 Multi-HIV蛋白飼喂 BALB/c小鼠，結(jié)果同樣引發(fā)了包含 gp120 V3環(huán)和gp41 ELDKWA表位的中和抗體和特異性干擾素γ生成；脾細胞增殖試驗也表明gp120的C4、V3結(jié)構(gòu)域和gp41的ELDKWA結(jié)構(gòu)域表位積累能引起陽性細胞反應(yīng)，刺激脾細胞增殖。實驗結(jié)果證明表達的重組 Multi-HIV抗原蛋白具有免疫活性，可作為HIV疫苗的替補疫苗，同時也表明高等植物葉綠體表達系統(tǒng)是表達疫苗抗原等藥物蛋白的有效途徑。

2017年，Yanez等[45]使用自我復(fù)制表達載體(pRIC3.0)、亞細胞定位和基因沉默抑制劑 (NSs和 P19蛋白) 等手段，首次在煙草葉綠體中融合表達LALF32-51-E7治療性疫苗，以期改善其在大腸桿菌表達系統(tǒng)中表達量低下的問題。E7蛋白是針對人乳頭瘤病毒 (Human papillomavirus，HPV) 的關(guān)鍵抗原，LALF32-51(Limulus polyphemus anti-lipopolysaccharide factor) 是一種具有免疫調(diào)節(jié)功能的細菌細胞膜穿透肽。結(jié)果發(fā)現(xiàn)自我復(fù)制表達載體和葉綠體定位相結(jié)合，疫苗蛋白在葉綠體中的積累量是細胞質(zhì)中的 27倍，占 TSP總量的0.5%；而基因沉默抑制劑對蛋白積累量的影響十分微弱。已有報道證實大腸桿菌中表達的LALF32-51-E7疫苗蛋白能在小鼠體內(nèi)成功引發(fā)免疫反應(yīng)，并可抑制腫瘤形成[47]。通過進一步改良重組蛋白的提取和純化工藝，有望生產(chǎn)出治療HPV的重組疫苗。

2016年，Chan等[44]也以煙草葉綠體為平臺，融合表達了一種針對骨髓灰質(zhì)炎病毒的加強型疫苗CTB-VP1 (Viral protein 1)。VP1屬于骨髓灰質(zhì)炎病毒衣殼蛋白，與現(xiàn)有疫苗 IPV (Inactivated poliovirus vaccine) 不同。煙草葉綠體中表達的口服加強疫苗VP1生產(chǎn)成本低，且無需低溫保藏運輸系統(tǒng)；凍干植物細胞可直接在常溫下保存數(shù)月，其中包含的疫苗蛋白仍能進行正確加工折疊，保持較好活性。通過對疫苗蛋白的抗原性和免疫活性進行檢測，結(jié)果顯示單一的IPV疫苗注射雖然能有效引發(fā)大量中和抗體的生成，但粘膜免疫的效果十分微弱；而僅口服加強型疫苗VP1也不能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體抗原中和免疫反應(yīng)。研究將IPV注射和 VP1口服相結(jié)合，并輔以植物性佐劑皂苷(Saponins) 和角鯊烯 (Squalene)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對骨髓灰質(zhì)炎Sabin1、2、3三種病毒株都展現(xiàn)出了高抗體中和滴度，且血清陽性率達到70%–90%。實驗結(jié)果為預(yù)防骨髓灰質(zhì)炎提供了新的途徑，同時低生產(chǎn)成本也為許多發(fā)展中國家和貧困地區(qū)帶來了福音。

煙草具有生物量大的顯著優(yōu)勢，每株煙草平均能產(chǎn)生上百萬顆種子。若能實現(xiàn)疫苗抗原在煙草葉綠體中高量表達，再通過種子繁殖，可以大幅降低疫苗生產(chǎn)和運輸成本[2]。其他高等植物葉綠體中也有抗原蛋白成功表達。2013年，Maldaner等[33]在生菜葉綠體中表達了一種針對登革病毒(Dengue virus，DENV) 血清檢測的四表位多聚肽抗原，有望用于登革病毒ELISA檢測試劑盒的商業(yè)開發(fā)。

除疫苗抗原外，生長因子、干擾素等藥物蛋白也一直是葉綠體表達研究的熱點。譬如，2011年Boyhan等[27]在生菜和煙草葉綠體中同時表達了霍亂毒素 B亞基和人胰島素原 (A、B、C肽)的融合蛋白。葉片中重組蛋白表達量均達到TSP的40%以上?？诜蜃⑸渲亟M蛋白的免疫小鼠均出現(xiàn)血糖降低現(xiàn)象，表明該重組蛋白具備降低血糖的功效。2012年，Khan等[29]構(gòu)建了干擾素IFNα-5的煙草葉綠體表達載體 (LBS:PrbcL:RF5::Prrn:aadA:TpsbA:RBS) 并導(dǎo)入葉綠體中表達。ELISA檢測發(fā)現(xiàn)重組蛋白含量在成熟葉片中最高可達到4 372 pg/g。2015年，Wang等[39]首次在煙草葉綠體中成功表達堿性成纖維細胞生長因子 (Basic fibroblast growth factor， bFGF)。Southern blotting檢測結(jié)果證實外源基因已整合進葉綠體基因組中；ELISA免疫印跡檢測顯示轉(zhuǎn)化植株葉片中重組蛋白含量約占TSP的0.1%。

當前有關(guān)植物葉綠體表達藥物蛋白的報道越來越多，多數(shù)蛋白的表達量高且具備生物活性。因此，高等植物葉綠體表達系統(tǒng)具有開發(fā)成商業(yè)化植物生物反應(yīng)器的前景。

中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所沈桂芳教授的葉綠體基因工程實驗室在高等植物葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化方面也取得了較好的研究成果，先后在煙草葉綠體中成功表達了口蹄疫病毒主要抗原VP1基因[48]、豬瘟病毒主要抗原E2基因[49]等動物植物疫苗。此前，我們實驗室在衣藻葉綠體中分別表達了人可溶性 TRAIL蛋白[50]和來源于嗜熱古細菌Pyrococcus furiosu s的耐高溫α-淀粉酶[51]，并構(gòu)建了含豬瘟病毒E2基因的豆科牧草百脈根的葉綠體轉(zhuǎn)化載體[52]。目前，實驗室正在進行紫花苜蓿葉綠體轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化工作。我們對外源基因及其調(diào)控序列進行了優(yōu)化，采用混合型啟動子PrrnPclpPrbcL，根據(jù)轉(zhuǎn)化植物葉綠體基因組密碼子的偏好性對外源基因進行了優(yōu)化合成，以期提高外源基因的表達量。

葉綠體具有折疊、組裝復(fù)雜蛋白的能力，且能在轉(zhuǎn)錄后對其進行二硫鍵、脂質(zhì)等加工修飾，這些特點對重組蛋白的翻譯后修飾，增強和發(fā)揮抗體、抗原的生物活性是十分必要的[29]。同時，葉綠體表達系統(tǒng)不具備糖基化修飾功能，為一些不需要此修飾功能的藥物蛋白如胰島素、駱駝單鏈抗體的表達開辟了新途徑[3,53]。此外，某些真核重組蛋白對細胞內(nèi)的蛋白水解較敏感，而高等植物葉綠體中含有的蛋白酶是原核特性，因此可為這類重組蛋白的表達提供一個相對穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境[42]。

3 重組蛋白對植物性狀和代謝的影響

葉綠體是植物光合作用的主要場所。由于起源和基因組結(jié)構(gòu)的特殊性，使葉綠體在重組蛋白表達方面具有一定的優(yōu)越性。但一些重組蛋白的表達又會對葉綠體或植株自身新陳代謝產(chǎn)生一定的影響。譬如，Dhingra等[24]在胡蘿卜的體細胞胚葉綠體中表達甜菜堿醛酶基因，提高了轉(zhuǎn)化植株的耐鹽性能；Yabuta等[31]在生菜葉綠體中表達維生素E相關(guān)的環(huán)化酶、轉(zhuǎn)移酶等基因，使生菜中維生素E含量和活性都得到了提高。因此，通過葉綠體基因工程研究重組蛋白的表達對植株性狀和代謝的影響，為葉綠體生物反應(yīng)器的開發(fā)和利用提供知識儲備和理論依據(jù)。

2009年，Apel等[26]為探究類胡蘿卜素生物合成途徑，在番茄葉綠體中分別表達了來源于草生歐文氏菌Erwinia herbicola和高等植物水仙花Narcissus pseudonarcissus的番茄紅素-β-環(huán)化酶基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)真菌來源的環(huán)化酶的表達對番茄類胡蘿卜素的生物合成不產(chǎn)生明顯影響；而水仙花的環(huán)化酶在番茄葉綠體中的表達會促使番茄中的番茄紅素轉(zhuǎn)化成維生素原 A (β-胡蘿卜素)，含量在干重葉片中可達到1 mg/g。表明番茄葉綠體中類胡蘿卜素的生物合成可能受水仙花番茄紅素-β-環(huán)化酶基因表達產(chǎn)物的調(diào)控。2015年，Roding等[54]在煙草葉綠體中表達酮式類胡蘿卜素，植物體光合效率發(fā)生變化。觀察T1代轉(zhuǎn)化植株發(fā)現(xiàn)，每克干重中光合成色素含量降低，但 Chla/Chlb的比率不變；這些酮式類胡蘿卜素主要集中在類囊體膜上，隨著積累量增多而使類囊體脂質(zhì)層發(fā)生變化，最終導(dǎo)致基粒合成減少，光合作用受到影響。

通過葉綠體基因工程研究了解類胡蘿卜素生物合成相關(guān)途徑及對植物功能的影響，進一步研究類胡蘿卜素在植物體內(nèi)的代謝合成機制，尋找能夠提高外源基因表達量且不影響植物執(zhí)行光合作用的因子，有望實現(xiàn)在可食植物細胞內(nèi)表達并開發(fā)成對人類健康有益的生物產(chǎn)品。

2014年，Pantaleoni等[34]以煙草葉綠體為平臺表達耐熱木聚糖酶。通過對酶活、植株形態(tài)等生理生化指標進行檢測分析，結(jié)果表明在外界強光條件下生長的轉(zhuǎn)基因煙草表達的木聚糖酶酶活相較于溫室下生長的更高；但木聚糖酶的表達卻使轉(zhuǎn)化植株的葉綠體結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生了變化，如類囊體減少、淀粉顆粒變大。純化后的木聚糖酶在4 ℃下可有效保存12個月，內(nèi)源蛋白酶對其幾乎不產(chǎn)生干擾作用。因此，可利用煙草葉綠體大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白木聚糖酶，為釀酒、飼料加工提供工業(yè)酶類。

強光照射會影響植物的生長發(fā)育。早先有研究發(fā)現(xiàn)在煙草葉綠體中表達超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD) 或谷胱甘肽還原酶(Glutathione reductase，GR) 會增強某些活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS) 的清除活性，并改變植株對非生物壓力的反應(yīng)，降低 UV-B照射對植物造成的傷害。為了探究選擇性改變?nèi)~綠體內(nèi)抗氧化途徑是否會影響過氧化物酶的清除活性，Czégény等[40]在煙草葉綠體中共同表達了GR和脫氫抗壞血酸還原酶 (GR plus DHAR)、GR和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶 (GR plus GST) 融合基因。通過對 UV-B照射后轉(zhuǎn)化植株和野生株的各類酶活參數(shù)進行測定，研究結(jié)果表明相對于野生株，兩種轉(zhuǎn)化植株對過氧化物酶的依賴性均減少；GR plus DHAR轉(zhuǎn)化株中非酶類清除劑對羥基自由基清除的能力提高不明顯。這突顯了細胞內(nèi)抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)在適應(yīng)UV照射時的重要性。雖然已有報道指出在強氧化條件下，抗壞血酸能幫助植物對抗短時間、高劑量的UV-B照射[55]，但作者發(fā)現(xiàn)酶催化清除過氧化氫是長時抵御 UV-B的關(guān)鍵因素。但這些酶的表達如何影響植物代謝仍需要更深入的研究。

以上植物葉綠體中表達的重組蛋白種類、結(jié)構(gòu)各異，因此對轉(zhuǎn)化植株性狀和代謝產(chǎn)生的影響也呈現(xiàn)出多樣性。在保持重組蛋白自身活性的基礎(chǔ)上對其進行序列改造，研究重組蛋白與植物次生代謝之間的相互作用，從而得到作用機制明確、有應(yīng)用價值的重組蛋白。此外，為了建立更高效的葉綠體表達系統(tǒng)，重組蛋白是否參與細胞信號調(diào)控等方面仍需要開展更多的研究，使植株在生長過程中能自主選擇沉默有害基因，而保證重組蛋白的高量表達[56]。

在研究葉綠體表達重組蛋白的同時，植物葉綠體基因工程也可用于某些基因的功能研究。2017年，Li等[57]在煙草葉綠體中表達來自棉葉枯病菌完整的hpaXm基因和去除該基因N端一段類似信號肽序列 (1–45 bp) 的突變體。免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)完整 hpaXm蛋白在葉綠體中表達后會遷移至細胞質(zhì)、細胞膜、線粒體、細胞核甚至細胞壁上；而突變體hpaXm卻被限制在葉綠體內(nèi)，無法跨膜穿越。同時兩種蛋白都表現(xiàn)出生物活性。由此證明 N端一段類似信號肽的序列對發(fā)揮hpaXm基因正常功能并不是必要的，但能幫助它重新遷移定位。

4 葉綠體中外源基因表達的優(yōu)化

盡管許多重要重組蛋白質(zhì)都已在高等植物(煙草、番茄、油菜、胡蘿卜等) 葉綠體中成功表達，但表達量低下仍是限制葉綠體基因工程技術(shù)發(fā)展和應(yīng)用的重要因素[26]。目前，相關(guān)研究主要致力于優(yōu)化外源基因序列、設(shè)計高效的葉綠體表達載體等，以期提高外源基因表達量。

4.1 優(yōu)化5’端調(diào)控序列，提高重組蛋白表達量

啟動子、終止子等調(diào)控元件的選擇和組合方式、轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的差異、mRNA和蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、核基因表達產(chǎn)物等都會對重組蛋白表達量產(chǎn)生影響。以5’端調(diào)控序列元件為例，2016年Gerasymenko等[43]將β-葡萄糖醛酸酶基因分別和菜豆Phaseolus vulgarisL、擬南芥Arabidopsis thaliana的rbcL基因 5’調(diào)控序列、蒺藜苜蓿Medicago truncatulaGaertn的rbcL和psbA基因的5’調(diào)控序列組合，研究 5’端調(diào)控序列對外源基因在葉綠體中表達的影響。檢測結(jié)果顯示蒺藜苜蓿的psbA基因啟動子和5’-UTRs序列調(diào)控的β-葡萄糖醛酸酶表達量最高，是其余調(diào)控序列的2–3倍；菜豆的rbcL基因啟動子和5’-UTRs序列調(diào)控的表達量接近于煙草rbcL基因自身調(diào)控水平。進一步研究發(fā)現(xiàn)蒺藜苜蓿psbA基因和菜豆、煙草的rbcL基因在轉(zhuǎn)錄水平上的差異不大。因此，推測轉(zhuǎn)化植株中 β-葡萄糖醛酸酶的高表達主要是受psbA基因5’-UTRs序列的翻譯水平的影響。

2013年Kolotilin等[58]也設(shè)計了4種不同的表達載體 (CEC1–4)，以期提高半纖維素酶在煙草葉綠體中的表達量。研究以細菌木聚糖酶XynA為外源基因，煙草 cv.81V9植株為轉(zhuǎn)化對象。結(jié)合轉(zhuǎn)化后植株的生長狀況、mRNA和重組蛋白的積累情況發(fā)現(xiàn)，抗性表達盒由IEE+SD：aadA：TpsbC組成 (IEE指順反子間表達元件；SD是來自細菌T7g10 5’-UTR的序列)；并以psbA基因啟動子及其 5’UTR序列 (添加 T7g10序列)、rbcL基因終止子作為外源基因調(diào)控序列能顯著提高重組蛋白積累量，一株轉(zhuǎn)化植物 cv.81V9中約能產(chǎn)生18.3 mg重組蛋白；且轉(zhuǎn)化植株生長發(fā)育正常。反之，其他幾種表達載體介導(dǎo)重組蛋白表達或是對植株表型產(chǎn)生影響，或是蛋白積累量低。

在 CEC4表達載體模式的基礎(chǔ)上，將目的基因換成黑曲霉Aspergillus niger的xyn10A和xyn11B基因，轉(zhuǎn)化對象換成生物量更高的植株型cv.I64。實驗結(jié)果顯示xyn11B的積累量達到TSP的6.0%，遠遠高于xyn10A的表達量0.2%。但當載體上T7g10序列移除后，xyn10A的表達量明顯提高，占TSP的3.3%；反之，xyn11B含量則下降，TSP中僅有2.5%。結(jié)果說明T7g10序列在表達外源基因時具有重要的調(diào)控作用。

重組蛋白表達量是衡量表達體系是否優(yōu)良的重要指標。從上述研究結(jié)果不難發(fā)現(xiàn)，選擇和利用高效的調(diào)控序列并進行適當組合可以有效實現(xiàn)重組蛋白的高表達[58]。

4.2 優(yōu)化外源基因密碼子，提高表達量

不同植物種類中葉綠體基因組的堿基構(gòu)成和密碼子具有很強的偏好性。密碼子偏好性也是影響外源基因在葉綠體中表達量的重要因素。葉綠體起源于原核生物，其基因組的堿基組成和密碼子的偏好性都具有原核性。根據(jù)葉綠體基因組密碼子的偏好性優(yōu)化合成外源基因是提高外源基因表達量的途徑。

2017年，Kwon等[59]根據(jù)133種植物葉綠體中的psbA基因編碼偏好性，對 Human clotting factor VIII heavy chain (FVIIIHC) 和Polio viral capsid protein1 (VP1) 蛋白基因序列進行優(yōu)化并導(dǎo)入煙草葉綠體中表達。蛋白檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以psbA基因密碼子使用頻率等級優(yōu)化的方式優(yōu)于僅以高度偏好密碼子代替所有稀少密碼子的優(yōu)化方式，兩者 VP1蛋白的表達量相差 77–111倍。Parallel reaction monitoring (PRM) 檢測顯示，優(yōu)化的 VP1序列結(jié)合 Cholera nontoxic B subunit(CNTB) 蛋白，含量提高了22.5–28.1倍。此外，核糖體圖譜技術(shù)表明在FVIIIHC蛋白翻譯過程中核糖體會在CTC亮氨酸密碼子處暫停；VP1基因優(yōu)化序列上的絲氨酸密碼子簇觀察到有核糖體集聚區(qū)存在。實驗結(jié)果為密碼子偏好性影響重組蛋白的表達和表達量提供了有力證據(jù)。

4.3 融合表達，增加重組蛋白表達和積累

除了選擇強啟動子等調(diào)控元件提高重組蛋白表達量之外，近來研究發(fā)現(xiàn)目的基因融合表達能顯著增加重組蛋白積累量。

2015年，Albarrac等[38]在煙草葉綠體中融合表達來源于弓地剛形蟲Toxoplasma gondi的SAG1抗原蛋白和來自嬰兒利什曼蟲Leishmania infantum的熱激蛋白LiHsp83。實驗結(jié)果顯示兩者的融合表達顯著提高了SAG1抗原蛋白的積累量(相當于單一表達時的 500倍)，每克鮮重葉片中約含 0.1–0.2 μg SAG1抗原蛋白。由于 HSP90s蛋白在不同壓力脅迫下都具有較強的穩(wěn)定性，研究推測 LiHsp83在融合表達時能提高重組蛋白SAG1的穩(wěn)定性或是避免其被降解，從而提高了SAG1抗原蛋白表達量。此外，實驗對融合蛋白的免疫性和抗原性也進行了檢測，Western blotting檢測結(jié)果表明chLiHsp83-SAG1能被感染病原蟲的人類血清樣本中的IgG抗體識別，口服飼喂小鼠后也能引起免疫反應(yīng)。

2014年，Morgenfeld等[36]為提高人類乳頭瘤病毒E7抗原在植物細胞中的表達量，將E7抗原基因分別與β-葡萄糖醛酸酶基因以及引導(dǎo)它至類囊體腔內(nèi)的轉(zhuǎn)移肽編碼區(qū)融合在煙草葉綠體中表達。結(jié)果表明，GUS能幫助 E7提高自身穩(wěn)定性并共同抵抗蛋白水解，C端或N端融合了GUS的E7表達量比單一E7抗原蛋白表達高出30–40倍。同時，實驗還將E7、土豆X病毒衣殼蛋白 (CP) 和轉(zhuǎn)移肽 Str (來自光系統(tǒng)Ⅱ) 融合，表達獲得了StrE7和 StrE7CP兩種融合蛋白。檢測發(fā)現(xiàn)StrE7CP的表達量同E7-GUS類似，而StrE7融合蛋白的表達量高達80倍之多。實驗結(jié)果在一定程度上說明了類囊體腔定位對特定蛋白表達的重要性。關(guān)于葉綠體內(nèi)重組蛋白的高積累的確切原因還未可知，研究推測可能是類囊體腔內(nèi)環(huán)境簡單，蛋白酶水解機制不容易發(fā)揮作用，起到保護重組蛋白的作用。

4.4 阻斷負調(diào)控，促進重組蛋白表達

目前，對重組蛋白表達研究大都集中在對其實行正調(diào)控以提高表達量，而關(guān)于如何阻斷其負調(diào)控的研究則較少。2016年，de Marchis等[60]在煙草葉綠體中表達菜豆phaseolin蛋白時發(fā)現(xiàn)外源異質(zhì)蛋白在植物中表達時存在負調(diào)控機制。他們在葉綠體基因組中插入外源基因的同時在核基因組中也導(dǎo)入攜帶轉(zhuǎn)移肽的外源基因，核表達的重組蛋白在胞質(zhì)核糖體中合成后再轉(zhuǎn)移至葉綠體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)核表達重組蛋白在葉綠體中的積累啟動mRNA翻譯下調(diào)機制，抑制葉綠體中重組蛋白的表達。研究推測這可能起源于細菌的競爭性抑制機制。研究還發(fā)現(xiàn)當核表達的外源基因攜帶信號肽在基質(zhì)中合成并切除轉(zhuǎn)移肽、重新定位至類囊體后，就無法抑制葉綠體內(nèi)重組蛋白的表達。菜豆phaseolin蛋白不屬于葉綠體內(nèi)源異質(zhì)復(fù)合體，因此，它的負調(diào)控機制可適當延伸至其他一些可溶性外源蛋白的表達，這有助于進一步探究和了解植物葉綠體內(nèi)源蛋白和重組蛋白的表達調(diào)控機制。

重組蛋白表達量低是限制葉綠體表達平臺推廣和應(yīng)用的主要瓶頸。RNA的積累、蛋白合成和降解水平的平衡、細胞中糖類、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、鹽類等因素都會影響重組蛋白的穩(wěn)定性和表達量[26]。通過探究各種不同因素對蛋白表達的調(diào)控機理，建立較為完善、高效的葉綠體表達體系，為重組蛋白，尤其是重要藥用蛋白的商業(yè)化生產(chǎn)提供新的表達平臺。

5 存在的問題

煙草在高等植物葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化研究中應(yīng)用最為廣泛。葉綠體全基因組序列信息匱乏和組織培養(yǎng)體系不成熟是限制其他高等植物進入葉綠體轉(zhuǎn)化行列的兩大重要因素[15]。

目前利用高等植物葉綠體轉(zhuǎn)化平臺表達人、動物疫苗抗原、藥物蛋白等方面所取得了較為顯著的研究成果，但這些表達產(chǎn)物中能真正投入市場生產(chǎn)并應(yīng)用于臨床治療的卻十分有限；且表達的重組疫苗的免疫原性雖然在實驗小鼠身上得到初步驗證，但距離臨床試驗和應(yīng)用還很遠。大多數(shù)治療蛋白均以抗生素作為篩選標記，長期使用會使細菌產(chǎn)生耐藥性，不利于藥物的可持續(xù)發(fā)展[5,61]。此外，植物體內(nèi)包含的多種代謝產(chǎn)物是否會對抗體抗原等藥物蛋白的療效產(chǎn)生副作用也仍是一個未知數(shù)，臨床應(yīng)用上缺乏更為完善的植物葉綠體表達系統(tǒng)生物安全性評估體系。

重組蛋白在植物體葉綠體中的高效表達是否會對植物表型造成影響也成為人們關(guān)注的焦點。目前為止，大多數(shù)重組蛋白在葉綠體中表達都未發(fā)現(xiàn)植物表型發(fā)生明顯變化；但也有報道稱部分重組蛋白在葉綠體中表達改變了植物表型，包括葉片變黃、生長速度減慢以及雄性不育等[62-63]。例如，Rigano等[64]在煙草葉綠體中表達牛痘病毒免疫蛋白A27L，轉(zhuǎn)化植株相對于陽性對照核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶的大小亞基積累減少，在土壤中的生長速度也減慢，葉片呈現(xiàn)褪綠現(xiàn)象。

6 小結(jié)與展望

煙草是高等植物葉綠體基因工程中應(yīng)用最為廣泛的模式植物之一，許多品種 (尤其是N. benthamiana) 被認為是用以表達生產(chǎn)重組蛋白的最佳系統(tǒng)[65]。80%–90%的重組蛋白都是在煙草葉綠體中表達成功，蛋白種類近百種，表達量最高可達70%[2]。與傳統(tǒng)大腸桿菌發(fā)酵系統(tǒng)相比，煙草葉綠體作為生物反應(yīng)器的成本要低 50倍之多[66]；且其生物量大，一株煙草能產(chǎn)生約上百萬顆種子，每畝煙草平均每年能收獲6 t多葉片[29]。雖然在植物葉綠體中表達了一系列重要的藥用重組蛋白，但重組蛋白表達量低仍是限制其商業(yè)開發(fā)的重要因素；此外從轉(zhuǎn)基因植物中分離純化重組蛋白也是限制植物生物反應(yīng)器開發(fā)的主要技術(shù)瓶頸。因此，今后可以在可食性植物中進行多樣嘗試，擴大高等植物葉綠體轉(zhuǎn)化受體范圍，以期生產(chǎn)出口服型疫苗抗原、抗體等重要藥用蛋白，提高植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)的藥用蛋白的市場競爭力。

隨著高等植物葉綠體在表達重組蛋白，尤其是藥物蛋白上的優(yōu)越性日益彰顯，葉綠體表達系統(tǒng)已成為分子生物技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點。通過不斷設(shè)計改造表達載體、探究細胞內(nèi)調(diào)控外源基因表達的影響因子，提高重組蛋白的表達量，簡化下游提取、純化工藝，降低生產(chǎn)成本，建立和優(yōu)化有效、安全、經(jīng)濟的葉綠體表達系統(tǒng)。此外，基于葉綠體基因組和植物細胞核基因組的信息交流與互作，建立葉綠體基因組與核基因組之間的相互調(diào)節(jié)作用網(wǎng)絡(luò)，探究核基因表達產(chǎn)物對葉綠體中新陳代謝途徑的影響及葉綠體中次生代謝產(chǎn)物如何反向調(diào)控核基因表達。隨著高等植物葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)和體系日益成熟，相信以此為基礎(chǔ)的藥用蛋白將進一步推動世界醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，為人類帶來福利。

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