雷公藤多苷對貝伐珠單抗誘導(dǎo)的小鼠蛋白尿的影響及其相關(guān)機制的研究

聞　妹，陳映霞，馬興群，黃　勇，曹夢苒，江　超

過去十年中，血管形成抑制劑已廣泛應(yīng)用于臨床，貝伐珠單抗(bevacizumab，BEV)為新型抗血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的人源化單克隆抗體，通過選擇性地結(jié)合VEGF，阻止VEGF與其受體結(jié)合，進而抑制新生血管的形成，達到抑制腫瘤生長的目的。蛋白尿是BEV較常見的不良反應(yīng)之一，通過抑制血管內(nèi)皮生長因子信號通路，導(dǎo)致腎功能損傷。這一不良反應(yīng)目前尚無有效預(yù)防及治療方法，一旦出現(xiàn)3級及3級以上蛋白尿，建議停用血管形成抑制劑，很大程度上降低了其臨床治療效果[1]。多項研究[2-3]證實雷公藤多苷片(Tripterysiumwilfordiipolyglucoside，TWP)可以通過維持腎小球足細胞的功能，降低糖尿病腎病相關(guān)蛋白尿。該研究在體外研究的基礎(chǔ)上[4]，觀測TWP對BEV相關(guān)小鼠腎損傷的修復(fù)作用并探索討論其作用機制。

1　材料與方法

1.1材料選用清潔級雄性ICR(institute of cancer research)小鼠30只，由南京軍區(qū)總院實驗動物中心提供。BEV注射液購自瑞士羅氏制藥公司；雷公藤多苷片購自上海復(fù)旦復(fù)華有限公司；cDNA第一鏈合成試劑盒購自美國 Thermo Fisher (K1622)公司；氯仿(500 ml)、異丙醇(500 ml)購自中國南京化學(xué)試劑有限公司；兔抗鼠VEGF單克隆抗體、兔抗鼠nephrin單克隆抗體、兔抗鼠podocin單克隆抗體購自美國Abcam公司。

1.2實驗分組30只健康清潔級實驗小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為5組： 對照組：尾靜脈注射相同體積生理鹽水，1次/周，共4周；BEV組：尾靜脈注射BEV 60 mg/(kg·周)，共4周；BEV+TWP1組：尾靜脈注射BEV 60 mg/(kg·周)，喂服TWP 4 mg/(kg·d)，共4周；BEV+TWP2組：尾靜脈注射BEV 60 mg/(kg·周)，喂服TWP 8 mg/(kg·d)，共4周； BEV+TWP3組：尾靜脈注射BEV 60 mg/(kg·周)，喂服TWP 16 mg/(kg·d)，共4周；每周稱體重調(diào)整用藥劑量。4周后采集小鼠24 h尿液，測量尿蛋白總量；采集小鼠血液標本，檢測血液中血尿素氮(blood ureanitrogen，BUN)、血肌酐(serum creatinine scr，Scr)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic oxalacetic transaminase，AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamic-pyruvic transaminase，ALT)等生化指標。最后解剖小鼠，取出腎組織，HE染色方法觀察腎小球結(jié)構(gòu)改變，通過電鏡觀察足細胞超微結(jié)構(gòu)變化，免疫組化方法觀測腎組織VEGF、nephrin及podocin蛋白表達變化，Q-PCR方法檢測VEGF mRNA、podocin mRNA及nephrin mRNA表達。實驗觀察過程中，動物自由活動、飲水、進食。

1.3標本收集4周末收集24 h尿液，測尿中蛋白總量，眼球取血，檢測血液中Scr、BUN、AST、ALT等指標。解剖小鼠，取出腎組織，行免疫組化及分子檢測。

1.424h尿蛋白測定根據(jù)試劑盒說明書測定。

1.5血生化指標血清Scr、BUN、AST、AST等生化指標按照試劑說明書在全自動化生化儀上檢測。

1.6腎組織的光鏡檢查取一部分腎組織，大小約0.5 cm，10%福爾馬林固定，石蠟包埋，切片厚度2 μm，行HE染色后光鏡下觀察。

1.7電鏡檢測足細胞超微結(jié)構(gòu)改變?nèi)⌒∮? mm3腎組織塊，用2.5%戊二醛固定，用0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗3次。1%鋨酸固定液固定2～3 h，再用0.1 mol/L 磷酸漂洗液漂洗3次；最后經(jīng)脫水、烘烤、染色后，Hitachi7500透射電鏡下觀察足突和基膜改變，拍片。

1.8免疫組化法觀察腎組織VEGF、nephrin、podocin分布將石蠟切片脫蠟，加入兔抗鼠抗體(VEGF、podocin、nephrin稀釋濃度均為1 ∶100)孵育4 ℃過夜，嚴格按照試劑盒說明操作，切片完成后光鏡下觀察。

1.9Q-PCR分析VEGF、nephrin、podocinmRNA的表達操作嚴格按照Q-PCR試劑盒說明書進行，引物均由南京思普金科技有限公司提供。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：起始模板RNA 2 ng，反應(yīng)體系為10 μl，每個檢驗指標做3個復(fù)孔。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s。引物分別是qmPodocin(123 bp) F:5′-GACCAGAGGAAGGCATCAAGC-3′,R:5′-GCACAACCTTTATGCAGAACCAG-3′;qmVEGF(105 bp) F:5′-CACATAGAGAGAATGAGCTTCC-3′,R:5′-CTCCGCTCTGAACAAGGCT-3′；qmNephrin(87 bp) F:5′-TCTGGGTCCAAACCCTAAGATT-3′,R:5′-TCAATAAGCAGGTGGAACTCAC-3′。

2　結(jié)果

2.124h尿蛋白比較BEV組24 h尿蛋白量顯著高于對照組；與BEV組比較，BEV+TWP2、BEV-TWP3組24 h尿蛋白量明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；BEV+TWP1 24 h尿蛋白量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1。

圖1　各組小鼠24 h尿蛋白量的變化

A：對照組；B：BEV 組；C： BEV-TWP1組；D：BEV-TWP2組；E： BEV-TWP3組;與對照組比較：**P<0.01；與BEV組比較：##P<0.01

2.2血生化分析各組小鼠ALT、AST、BUN、CREA差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表 1)。

2.3腎組織病理變化光鏡下觀察對照組小鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常；BEV+TWP1、BEV組小鼠腎小球內(nèi)皮細胞縮小，改變后的結(jié)構(gòu)呈空泡狀；與BEV組比較，BEV+TWP2、BEV-TWP3組腎小球結(jié)構(gòu)有明顯恢復(fù)，見圖2。

2.4電鏡方法觀察腎足細胞超微結(jié)構(gòu)對照組:足細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；BEV組、BEV-TWP1組：足細胞足突顯著減少、廣泛融合，微絨毛減少、變短，內(nèi)皮孔明顯增多、擴大、不規(guī)則，基底膜局部增厚；BEV-TWP2組、BEV-TWP3組：足細胞足突融合、微絨毛減少、基底膜增厚均明顯改善，內(nèi)皮孔分布正常，BEV-TWP3組小鼠的足細胞接近正常。見圖3。

陽極浸在稀硫酸溶液中,電解過程中生成較多H+,H+可透過陽離子交換膜定向遷移到產(chǎn)品室。陰極浸在氫氧化鈉溶液中,電解過程中生成較多的OH-,由于陽離子交換膜的限制,只可能是原料室中Na+定向遷移到陰極室,以使陰極室正、負電荷保持平衡。這導(dǎo)致原料室中向產(chǎn)品室定向遷移,必定會跟陽極室遷移過來的H+反應(yīng)生成次磷酸。強還原性微粒容易在陽極被氧化,若將陽極直接浸入次磷酸溶液中,必定會有次磷酸直接被氧化成亞磷酸、磷酸等,產(chǎn)品就會有多種雜質(zhì)。

2.5免疫組化檢測VEGF、nephrin、podocin蛋白的表達免疫組化結(jié)果：對照組、BEV+TWP2、BEV-TWP3組小鼠腎組織VEGF的表達為中、強陽性，BEV組為陰性或弱陽性。見圖4～6。

表1　各組小鼠血清生化指標的比較

圖2　小鼠腎小球變化　HE×400

圖3　各組小鼠電鏡下足細胞結(jié)構(gòu)變化

2.6Q-PCR檢測小鼠腎組織VEGF、nephrin、podocinmRNA表達VEGF、nephrin、podocin蛋白與mRNA表達量情況，BEV組較對照組明顯降低，BEV+TWP2、BEV-TWP3較BEV組顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；BEV+TWP1組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖7。

3　討論

BEV在應(yīng)用4周后其24 h蛋白尿的發(fā)生率顯著升高。參照相關(guān)研究，根據(jù)BEV臨床使用劑量，在預(yù)實驗中設(shè)計了三組不同的劑量來誘導(dǎo)蛋白尿的產(chǎn)生。結(jié)果顯示，小鼠被注射BEV 4周后，腎臟出現(xiàn)腎小球內(nèi)皮細胞萎縮、空泡狀改變等病理變化。電鏡下顯示腎足細胞出現(xiàn)足突明顯減少、足突融合增寬、微絨毛稀疏變短、基底膜局部增厚等超微結(jié)構(gòu)改變。這些異常均表明蛋白尿的發(fā)生與BEV對足細胞損傷密切相關(guān)。且BEV導(dǎo)致的損傷具有劑量相關(guān)性。而各組小鼠的Scr、BUN、ALT、AST無顯著差異，表明足細胞結(jié)構(gòu)的損傷不至于引起明顯的腎功能變化。臨床上也顯示，蛋白尿的產(chǎn)生并不意味著腎功能會在短期內(nèi)出現(xiàn)明顯變化。

VEGF家族是血小板源生長因子超家族中最重要的成員，腎小球足細胞和腎小管上皮細胞VEGF的表達最顯著，VEGF有助于促進血管內(nèi)皮細胞增殖和新生血管的形成，在維持足細胞功能與基底膜蛋白方面具有重要作用[5-8]。將足細胞VEGF基因敲除，會降低腎小球基底膜重要組成部分、裂隙孔膜相關(guān)蛋白nephrin的表達，最終導(dǎo)致蛋白尿的形成[9]。在本實驗中，通過免疫組化、Q-PCR顯示VEGF蛋白和mRNA表達量與蛋白尿具有相關(guān)性。這與之前的研究[10]結(jié)果吻合。

圖4　各組小鼠足細胞VEGF蛋白表達　免疫組化×400

圖5　各組小鼠足細胞nephrin蛋白表達　免疫組化×400

圖6　各組小鼠足細胞podocin蛋白表達　免疫組化×400

圖7　Q-PCR檢測VEGF、nephrin、podocin 基因表達

A:VEGF mRNA；B:nephrin mRNA；C:podocin mRNA；1：對照組；2：BEV 組；3： BEV-TWP1組；4：BEV-TWP2組；5： BEV-TWP3組；與對照組比較：**P<0.01；與BEV組比較：##P<0.01

本實驗顯示，BEV可降低足細胞VEGF的表達，抑制足細胞相關(guān)蛋白nephrin、podocin的表達，進而造成足細胞損傷，最后導(dǎo)致蛋白尿。

TWP具有保護和修復(fù)腎小球電荷屏障、抑制免疫應(yīng)答、改變腎小球機械屏障的損傷等作用，是治療糖尿病腎病等蛋白尿臨床常用藥物之一，其療效和安全性得到大多數(shù)學(xué)者的認可[11]。本試驗證實足細胞損傷是BEV相關(guān)蛋白尿主要發(fā)生機制之一，nephrin與podocin的表達降低將引起裂孔膜疏松、消失，濾過屏障損壞，從而出現(xiàn)蛋白尿。文獻[12]報道TWP具有上調(diào)nephrin、podocin表達，改善足細胞損傷的作用。本研究在使用BEV的基礎(chǔ)上采用不同劑量的TWP[4、8、16 mg/(kg·d)]干預(yù)，結(jié)果顯示小鼠24 h尿蛋白明顯下降。光鏡下顯示中、高劑量TWP導(dǎo)致的一系列病理改變病變明顯緩解，Q-PCR、免疫組化結(jié)果顯示經(jīng)過TWP干預(yù)的小鼠VEGF、nephrin、podocin表達明顯恢復(fù)。小鼠足細胞病變改善程度與TWP劑量正相關(guān)，主要的機制是TWP通過修復(fù)小鼠足細胞損傷，增加腎小球nephrin、podocin表達。

TWP的毒性始終是人們關(guān)注的問題，尤其是肝腎功能，本文采用的TWP劑量參考了大量糖尿病腎病的實驗研究，證明采用的劑量未引起明顯不良反應(yīng)[13-14]。TWP(20 mg， 口服TID)治療BEV誘導(dǎo)的蛋白尿個案中，患者服用TWP期間定期檢查生化指標，無明顯異常，說明TWP是治療BEV相關(guān)蛋白尿的有效藥物，有進一步研究的價值。