剝奪小鼠睡眠后促覺醒中樞TMN內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞在睡眠-覺醒中的變化

洪　艷，施　伍，梁　悅，李曉鳳，王　媛，許　奇，伍龍軍，王烈成

長期以來,人們對(duì)于中樞睡眠和覺醒系統(tǒng)的研究,主要集中在眾多的神經(jīng)核團(tuán)及其遞質(zhì)上。這些核團(tuán)和遞質(zhì)彼此間形成相互作用、相互制約的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。目前認(rèn)為，下丘腦腹外側(cè)視前區(qū)(ventrolateral preopticnucleus nucleus，VLPO)與結(jié)節(jié)乳頭體核(tuberomammillary nucleus，TMN)分別是重要的促睡眠和促覺醒的調(diào)節(jié)中樞[1-2]。隨著研究的深入，小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的免疫功能細(xì)胞，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)新的功能作用不斷地被發(fā)現(xiàn)。小膠質(zhì)細(xì)胞是否也在睡眠-覺醒調(diào)控中起作用卻很少報(bào)道。睡眠剝奪常被作為研究睡眠-覺醒機(jī)制的一種重要研究方法[3]。該研究采用睡眠剝奪方式，使用已被證明可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化的四環(huán)素類抗生素藥物-米諾環(huán)素[4],探討小膠質(zhì)細(xì)胞在睡眠-覺醒穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中的作用。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組SPF級(jí)雄性8周齡C57BL/6小鼠共50只，25～28 g。均由北京維通利華提供，按不同組別將實(shí)驗(yàn)小鼠置于動(dòng)物房的獨(dú)立通風(fēng)籠盒內(nèi)飼養(yǎng)，光照8：00～20：00，溫度適宜，能夠自由攝食飲水。實(shí)驗(yàn)一：為了觀察米諾環(huán)素對(duì)正常睡眠小鼠是否有影響，將小鼠分為生理鹽水自然睡眠組(NS-TODS 組)和米諾環(huán)素自然睡眠組(mino-TODS組)，即在正式實(shí)驗(yàn)的第1～7天，早上8:00分別給兩組小鼠腹腔注射生理鹽水和米諾環(huán)素75 mg/kg。為了觀察米諾環(huán)素對(duì)睡眠剝奪小鼠是否有影響，將小鼠分為NS-TODS 組、睡眠剝奪生理鹽水組(NS-SD組)和睡眠剝奪米諾環(huán)素組(mino-SD組)。NS-TODS 組僅注射生理鹽水，不做其它特殊處理，另外兩組是在分別連續(xù)注射生理鹽水和米諾環(huán)素第7天后剝奪睡眠后行多導(dǎo)睡眠描記。實(shí)驗(yàn)二：為了觀察小鼠在TMN腦區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞熒光表達(dá)情況，同樣實(shí)驗(yàn)條件下，連續(xù)腹腔注射生理鹽水和米諾環(huán)素7 d以后，NS-SD組和mino-SD組行睡眠剝奪，NS-TODS 組僅注射生理鹽水自然睡眠5 h后，3組小鼠麻醉后行多聚甲醛灌流。

1.1.2儀器68030型小鼠腦立體定位適配器、高速顱骨鉆(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；MP150多導(dǎo)生理信號(hào)記錄分析系統(tǒng)(美國Biopac公司)；Sleepsign睡眠分析軟件(日本KisseiComte株式會(huì)社)；免疫熒光相關(guān)試劑(日本TaKaRa公司)；電極用銀絲(美國CoonerWire公司)；造牙粉、義齒基托樹脂(上海二醫(yī)張江生物材料有限公司)；記錄排線(東莞市耀博電子有限公司)；萊卡冰凍切片機(jī)DM1860、萊卡DM2500 熒光顯微鏡(德國萊卡公司)。

1.1.3試劑戊巴比妥鈉(上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站分裝廠進(jìn)口分裝)用蒸餾水配成0.04 g/L溶液；米諾環(huán)素(美國Sigma公司)；一抗：iba-1 兔源(日本W(wǎng)ako公司)；二抗：Alexa488 驢抗兔(美國Invitrogen 公司)，驢血清，冰凍切片包埋劑，防猝滅封片劑。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物手術(shù)小鼠經(jīng)戊巴比妥行腹腔麻醉后固定于小鼠腦立體定位適配器上，將小鼠頭頂毛剪去，酒精消毒皮膚并剪開，血管夾夾緊切口兩側(cè)皮膚，分離皮下組織，用生理鹽水洗凈后使顱骨完全暴露，分別位于前囟前1.0 mm、旁開1.5 mm和后囟前1.0 mm、旁開1.5 mm處用顱骨鉆鉆通顱骨，但不弄破硬腦膜，將腦電電極埋入，兩根肌電電極分別插入兩側(cè)的頸部肌肉內(nèi)。用牙科水泥將電極固定于顱骨上，腹腔注射青霉素，縫合傷口，將小鼠側(cè)臥位放入屏蔽箱恢復(fù)籠內(nèi)。

1.2.2多導(dǎo)睡眠描記方法小鼠手術(shù)后放入恢復(fù)籠內(nèi)恢復(fù)7 d，第8天將小鼠頭部電極通過所焊的記錄排線與多通道萬向輪連接，適應(yīng)3 d后，正式記錄。屏蔽箱內(nèi)光照8:00～20:00，記錄從早8：00(記為ZT0)開始，用Acqknowlege4.2軟件記錄小鼠的腦電肌電活動(dòng)，記錄過程中小鼠能夠自由飲食和攝水，活動(dòng)不受限制。每次描記均從8:00開始，連續(xù)記錄24 h。

1.2.3睡眠狀態(tài)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)腦電數(shù)據(jù)以4 s為時(shí)間段分析，將睡眠覺醒周期分為覺醒(wakefulness，W)，以低幅快波腦電和明顯肌電活動(dòng)為特征；非快動(dòng)眼睡眠(non-rapid eye movement，NREM)，以高幅慢波腦電和肌電活動(dòng)明顯減少為特征；快動(dòng)眼睡眠(rapid eye movement，REM)，以低幅慢波腦電和肌電安靜為特征；總睡眠時(shí)間(total sleep time，TST)是 REM 睡眠和 NREM 睡眠時(shí)間之和。

1.2.4睡眠剝奪方法睡眠剝奪時(shí)將小鼠置于有機(jī)玻璃圓桶(直徑22 cm，高38 cm)，從8：00 ～ 13：00 (ZT 0～5)對(duì)小鼠每隔15 s 用毛刷輕輕觸碰小鼠臀部，小鼠被強(qiáng)迫保持清醒狀態(tài)，以此達(dá)到睡眠剝奪的目的。此方法對(duì)小鼠的應(yīng)激水平較低，可以完全剝奪NREM睡眠和REM睡眠，較容易觀察小鼠睡眠剝奪后的反應(yīng)，所以本實(shí)驗(yàn)采用的是觸碰法[3]。

1.2.5冰凍腦組織制備小鼠麻醉后，經(jīng)左心室插管行心內(nèi)灌注固定。由胸骨劍突入刀，剪開胸腔充分暴露心臟包膜，用眼科剪刀剪開心包膜暴露整個(gè)心臟，止血鉗夾閉下腔靜脈，然后左心室插入輸液器針頭，迅速剪開右心耳。灌注分為兩部分：先快速灌注4 ℃生理鹽水，至流出液體變清；隨即灌注固定液4%的多聚甲醛(用PBS緩沖液配制)。灌注速度先快后慢，約20～30 min灌完。待僵硬后取出組織(較為完整的小鼠腦)，灌流完成。將取出的腦組織置于4%多聚甲醛(PBS緩沖液配制)中固定24 h，然后分別置于含10%、20%和30%蔗糖的PBS中脫水，待組織沉底后方可進(jìn)行冰凍切片。

1.2.6冰凍切片將用包埋劑包埋的腦組織迅速冰凍后進(jìn)行腦切片。切片的厚度為30 μm，對(duì)照小鼠腦立體定位圖譜(第二版,George Paxinos, Keith B J Frallklin),選取小鼠含有TMN腦區(qū)(圖1A)，視交叉上核(suprachiasmatic nucleus，SCN)腦區(qū)的腦片放置于4 ℃冰箱保存(圖1B)。

圖1　對(duì)照?qǐng)D譜選擇TMN、SCN腦片示意圖

1.2.7TMN和SCN中小膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)將含有TMN和SCN腦切分別用0.01 mol/L PBS清洗和0.3% TritonX-100通透處理后，再分別用一抗和二抗孵育。一抗為iba-1，小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞特異性蛋白抗體；二抗為Alexa fluor488，綠色熒光標(biāo)志物。

1.2.8定量分析小膠質(zhì)細(xì)胞直徑和光密度高倍鏡視野(×40倍鏡) 下分別采集3個(gè) SCN和TMN 區(qū)域圖像，使用 ImageJ-win32/fiji分析軟件處理圖像，用平均熒光密度(area of interest，AOI)值、細(xì)胞平均直徑、細(xì)胞個(gè)數(shù)反映各腦區(qū)蛋白表達(dá)水平。

2　結(jié)果

2.1米諾環(huán)素對(duì)自然睡眠小鼠睡眠-覺醒的影響自然睡眠狀態(tài)下小鼠分別腹腔注射生理鹽水和米諾環(huán)素7 d ，采用自由活動(dòng)腦電24 h連續(xù)監(jiān)測(cè)，結(jié)果顯示NS-TODS組和mino-TODS組的覺醒、REM睡眠以及NREM睡眠呈晝夜節(jié)律變化，兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

圖2　NS-TODS組和 mino-TODS組小鼠的24 h睡眠-覺醒統(tǒng)計(jì)圖

A：兩組小鼠覺醒量分布圖；B：兩組小鼠24 h總覺醒量統(tǒng)計(jì)圖；C：兩組小鼠REM 睡眠量分布圖； D：兩組小鼠24 h總REM睡眠時(shí)間統(tǒng)計(jì)圖； E：兩組小鼠NREM睡眠量分布圖； F：兩組小鼠24 h總NREM睡眠時(shí)間統(tǒng)計(jì)圖

圖3　睡眠剝奪5 h后NS-TODS組和NS-SD組小鼠的覺醒、REM睡眠和NREM睡眠時(shí)間的變化

A：兩組小鼠ZT 5～11覺醒量分布圖；B：兩組小鼠ZT 5～11 REM睡眠量分布圖；C：兩組小鼠ZT 5～11 NREM睡眠量分布圖；與NS-TODS組比較：*P<0.05

圖4　睡眠剝奪5 h后NS-SD組和mino-SD 組小鼠的覺醒-睡眠量統(tǒng)計(jì)

A：兩組小鼠ZT 5～11覺醒量分布統(tǒng)計(jì)圖；B：兩組小鼠ZT 5～6覺醒量統(tǒng)計(jì)圖；C：兩組小鼠ZT 5～11睡眠量分布統(tǒng)計(jì)圖；D：兩組小鼠ZT 5～6睡眠量統(tǒng)計(jì)圖；與NS-SD組比較：*P<0.05

2.2睡眠剝奪后對(duì)小鼠睡眠-覺醒的影響在腹腔連續(xù)注射生理鹽水第7天后剝奪小鼠睡眠5 h，然后開始記錄7 h的小鼠腦電(ZT 5～11)。結(jié)果顯示，與NS-TODS組相比，NS-SD組小鼠覺醒量有所減少，NREM睡眠量有所增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

2.3腹腔注射米諾環(huán)素對(duì)睡眠剝奪小鼠睡眠-覺醒的影響同樣，在腹腔連續(xù)注射米諾環(huán)素第7天后剝奪小鼠睡眠5 h，然后進(jìn)行多導(dǎo)睡眠記錄。與NS-SD組(13.30±2.378)相比，mino-SD組在ZT 5～6的時(shí)間段內(nèi)，其覺醒總量(23.10±1.768)有顯著性增加(P<0.05)。而在ZT 6～11時(shí)段內(nèi)，沒有顯著性變化(圖4 A、B)。對(duì)睡眠總量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示mino-SD組在ZT 5～6時(shí)間段內(nèi)，其TST睡眠總量(41.87±4.616)較NS-SD組(31.60±2.298)有明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而ZT6～11時(shí)間段內(nèi)，沒有顯著性變化(圖4 C、D)。

2.4睡眠剝奪后小鼠TMN和SCN腦區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的活力變化

2.4.1睡眠剝奪后小鼠TMN腦區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的活力變化經(jīng)過7 d腹腔注射米諾環(huán)素和生理鹽水，NS-TODS組小鼠自然睡眠5 h， NS-SD組、 mino-SD組小鼠睡眠剝奪5 h后即給予小鼠麻醉，制備冰凍切片。通過iba-1免疫熒光染色后，高倍熒光鏡下觀察，可見TMN區(qū)域小膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)綠色，細(xì)胞容易辨認(rèn)，結(jié)構(gòu)清晰，突起分明(圖5 A-C)。NS-SD組小膠質(zhì)細(xì)胞較NS-TODS組胞體更大，分支數(shù)目多，分支長度更長，熒光強(qiáng)度更亮。與mino-SD組相比，mino-SD組小膠質(zhì)細(xì)胞明顯細(xì)胞胞體變小，分支數(shù)目減少，長度變短。再將3組TMN區(qū)域的小膠質(zhì)細(xì)胞的直徑、熒光強(qiáng)度和數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，與NS-TODS組相比，NS-SD組小膠質(zhì)細(xì)胞直徑較大(t=3.747,P<0.01)，熒光強(qiáng)度較強(qiáng)(t=2.326,P<0.05)，而mino-SD組小膠質(zhì)細(xì)胞和NS-SD組相比,有變小的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖4 D-F。

2.4.2米諾環(huán)素對(duì)睡眠剝奪小鼠SCN腦區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響同條件下NS-TODS組、NS-SD組和mino-SD組小鼠冰凍切片通過iba-1免疫熒光染色后，高倍熒光鏡下觀察，可見SCN區(qū)域小膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)綠色，細(xì)胞容易辨認(rèn)，結(jié)構(gòu)清晰，突起分明(圖6 A-C)，從細(xì)胞胞體、細(xì)胞分枝數(shù)目、長度、熒光亮度對(duì)比，并未見明顯差別，將3組SCN區(qū)域的小膠質(zhì)細(xì)胞的直徑、熒光強(qiáng)度和數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，3組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖6 D-F。

3　討論

已有研究[5]顯示免疫系統(tǒng)對(duì)睡眠是有一定的影響，但此影響是否與腦中的先天的免疫細(xì)胞-小膠質(zhì)細(xì)胞有關(guān)還是未知的。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常駐吞噬細(xì)胞，通過持續(xù)監(jiān)測(cè)周圍的微環(huán)境，感知神經(jīng)元活動(dòng)，在細(xì)胞受傷和死亡后清除神經(jīng)元碎片，促進(jìn)健康大腦發(fā)育性突觸的修剪[6]。任何對(duì)腦內(nèi)穩(wěn)態(tài)的干擾，包括炎癥，都會(huì)激活小膠質(zhì)細(xì)胞，急性和慢性睡眠剝奪可導(dǎo)致無明顯感染或損傷的促炎狀態(tài)[7]。文獻(xiàn)報(bào)道，在人類和嚙齒類動(dòng)物中，睡眠缺失會(huì)導(dǎo)致白細(xì)胞計(jì)數(shù)升高，c-fos蛋白，IL-1，IL-6，TNF的增加[8]，血腦屏障增強(qiáng)通透性增加等[9]。小膠質(zhì)細(xì)胞特異性抑制劑，米諾環(huán)素，已被證明可以通過血腦屏障，抑制細(xì)胞因子、一氧化氮和前列腺素等產(chǎn)物的產(chǎn)生，減弱大腦由于這些產(chǎn)物造成的神經(jīng)化學(xué)變化[10]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射米諾環(huán)素的方法抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活性來檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞在睡眠覺醒調(diào)控中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示該抑制劑對(duì)正常睡眠小鼠的睡眠結(jié)構(gòu)沒有明顯的影響。

圖5　NS-TODS組、NS-SD組和mino-SD組小鼠TMN區(qū)域小膠質(zhì)細(xì)胞的熒光表達(dá)情況

A：NS-TODS組小鼠TMN區(qū)域的熒光圖；B：NS-SD組小鼠TMN區(qū)域的熒光圖；C：mino- SD組小鼠TMN區(qū)域的熒光圖；D：3組TMN區(qū)域小膠質(zhì)細(xì)胞直徑統(tǒng)計(jì)圖；E：3組TMN區(qū)域小膠質(zhì)細(xì)胞熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)圖；F：3組TMN區(qū)域小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)圖；與NS-TODS組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖6　NS-TODS組、NS-SD組和mino-SD組小鼠SCN區(qū)域小膠質(zhì)細(xì)胞的熒光表達(dá)情況

A：NS-TODS組小鼠SCN區(qū)域的熒光圖；B：NS -SD組小鼠SCN區(qū)域的熒光圖；C： mino-SD組小鼠SCN區(qū)域的熒光圖；D：3組SCN區(qū)域小膠質(zhì)細(xì)胞直徑統(tǒng)計(jì)圖；E：3組SCN區(qū)域小膠質(zhì)細(xì)胞熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)圖；F：3組SCN區(qū)域小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)圖

實(shí)驗(yàn)的第7天給予睡眠剝奪后，與注射鹽水組相比，注射米諾環(huán)素組早期出現(xiàn)覺醒的急性增加，可以推斷早期米諾環(huán)素抑制了小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，從而減少由于小膠質(zhì)細(xì)胞活化導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，覺醒增多，睡眠減少。Iba-1是小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞特異性蛋白抗體，通過觀察Iba-1的表達(dá)，反應(yīng)小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和不同狀態(tài)下的的活力[11]，睡眠剝奪與自然睡眠組相比較，在TMN，促覺醒腦區(qū)，小膠質(zhì)細(xì)胞的平均直徑增大、亮度增強(qiáng)，提示此腦區(qū)中的小膠質(zhì)細(xì)胞活躍程度增加。由此推測(cè)睡眠剝奪階段，由于覺醒腦區(qū)的持續(xù)激活，代謝產(chǎn)物，如細(xì)胞因子、一氧化氮和前列腺素等不斷堆積，導(dǎo)致覺醒區(qū)域的小膠質(zhì)細(xì)胞增大，變亮，作為免疫吞噬細(xì)胞來清除這些產(chǎn)物，以保護(hù)覺醒神經(jīng)元的過度激活。同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，應(yīng)用小膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑米諾環(huán)素組的小鼠睡眠剝奪后小膠質(zhì)細(xì)胞變小，亮度有變暗的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？梢赃M(jìn)一步推斷米諾環(huán)素減弱了小膠質(zhì)細(xì)胞的活化作用，在促覺醒腦區(qū)TMN區(qū)，小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)覺醒-睡眠的調(diào)節(jié)起了一定的作用。

同時(shí)本實(shí)驗(yàn)還觀察了和覺醒無關(guān)的腦區(qū)，反應(yīng)晝夜節(jié)律的腦區(qū)-視交叉上核(SCN)中小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物iba-1的表達(dá)情況，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示SCN區(qū)域小膠質(zhì)細(xì)胞的直徑、熒光強(qiáng)度和數(shù)量在3組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物未見明顯差異。說明在小膠質(zhì)細(xì)胞在此區(qū)域在此實(shí)驗(yàn)條件下并未對(duì)晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)發(fā)生明顯改變。

通過此實(shí)驗(yàn)推測(cè)，小膠質(zhì)細(xì)胞在過度激活狀態(tài)下對(duì)睡眠-覺醒的穩(wěn)態(tài)有調(diào)控作用，米諾環(huán)素抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活性，維持覺醒，延遲覺醒向睡眠推進(jìn)的時(shí)間。

參考文獻(xiàn)