黃酮水楊酸衍生物的合成及抗腫瘤活性測(cè)定

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(1.南華大學(xué)藥物藥理研究所，湖南省分子靶標(biāo)新藥研究協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.株洲市二醫(yī)院藥劑科)

黃酮是一種廣泛存在自然界中的多酚類化合物，具有廣泛的生物活性，如抗腫瘤，抗氧化，抗炎，抗菌等作用[1-4]。醋酸黃酮是最早的腫瘤血管阻斷劑[5]。目前，許多正在臨床試驗(yàn)的腫瘤血管破壞劑結(jié)構(gòu)中都具有苯三甲氧基基團(tuán)(圖1)，如CA4P及其類似物OXi4503和AVE8062[6-8]，秋水仙堿類似物ZD6126[9], BNC-105[10]和CKD-516[11]，苯三甲氧基團(tuán)對(duì)腫瘤藥物設(shè)計(jì)具有重要的研究?jī)r(jià)值。

眾所周知的抗炎藥物-乙酰水楊酸和水楊酸也顯示出較好的抗腫瘤活性[12-13]。基于上述考慮，本文作者提出將苯三甲氧基和水楊酸及其衍生物引入黃酮骨架，進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和衍生化，合成了一系列含有苯三甲氧基的水楊酸黃酮衍生物和白楊素水楊酸衍生物，并初步評(píng)價(jià)其抗腫瘤活性，尋找具有高效低毒的新型抗腫瘤候選藥物。

圖1 CA4P，OXi4503，AVE8062，ZD6126，BNC-105和CKD-516的結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1儀器Thermo Scientific Electrothermal Digital熔點(diǎn)測(cè)定儀，Bruker AV-400型光譜儀，Waters GCT質(zhì)譜儀，WellscanMK-2酶標(biāo)儀。

1.2材料3,4,5-三甲氧基苯酚(98%)、對(duì)羥基苯甲醛(98%)、氯乙腈(98%)、白楊素(98%)、4-氯水楊酸(98%)、5-氯水楊酸(98%)購(gòu)于阿拉丁試劑；胎牛血清FBS、RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)；柱層析硅膠板(安徽躍化硅材料有限公司)；其他試劑均為市售分析純。

1.3方法

1.3.1 5,6,7-三甲氧基-4′-羥基黃酮(2)的合成 如圖2所示。將3,4,5-三甲氧基苯酚(2.208 g,12 mmol)置于150 mL的三頸瓶中，加入氯仿-無(wú)水乙醚(1∶1)40 mL，冰浴冷卻，原料溶解完全后加入氯乙腈(1.5 mL,24 mmol)與無(wú)水氯化鋅(0.326 4 g,2.4 mmol)，充分混勻，通入干燥氯化氫，3 h后將反應(yīng)瓶4 ℃放置1天，再通氯化氫2 h，4 ℃放置1天，傾出氯仿-無(wú)水乙醚，過(guò)濾，氯仿-無(wú)水乙醚洗滌淡黃色沉淀，適量熱水將洗滌后的淡黃色沉淀溶解于圓底燒瓶中，水浴加熱回流1 h，4 ℃靜置過(guò)夜，抽濾，即得到化合物2′-羥基-4′,5′,6′-三甲氧基-2-氯苯乙酮(1)。

將化合物1(10 mmol)與對(duì)羥基苯甲醛(11 mmol)混合，加入5 mL 95%乙醇溶解，搖勻，慢慢加入2.5 mL 10%NaOH，室溫下攪拌2天，用10%HCl調(diào)節(jié)pH至有亮黃色沉淀析出，抽濾，沉淀用無(wú)水乙醇溶解，緩慢滴加蒸餾水直至有結(jié)晶出現(xiàn)，靜置過(guò)濾即得到化合物2。

1.3.2 化合物4a和4b的合成 如圖3所示。將5-氯水楊酸(5 mmol)溶解于15 mL蒸餾水中，37 ℃水浴加熱，用30% NaOH調(diào)節(jié)溶液pH為10，攪拌30 min，緩慢滴加2 mL硫酸二甲酯，若反應(yīng)液pH變?yōu)橹行?，?0%NaOH調(diào)節(jié)溶液pH為10，反應(yīng)1～2 h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程(展開(kāi)劑為二氯甲烷：甲醇 10∶1)，若反應(yīng)未完全則重復(fù)上述步驟，反應(yīng)完全則在80 ℃水浴條件下水解15 min，冷卻至室溫，10% HCl調(diào)節(jié)pH為5，有白色沉淀生成，蒸餾水洗滌沉淀，將沉淀真空干燥；將干燥后的沉淀溶于10 mL二氯甲烷，加入兩滴DMF(N,N-二甲基甲酰胺)和0.5 mL氯化亞砜，40 ℃油浴加熱回流0.5 h，減壓蒸除二氯甲烷和氯化亞砜，得化合物4a。

化合物4b與化合物 4a合成方法類似。

圖2 5,6,7-三甲氧基-4′-羥基黃酮(2)的合成路線

圖3 化合物4a和4b的合成路線

1.3.3 目標(biāo)化合物5a、5b、6a和6b的合成 化合物4a(5 mmol)用15 mL丙酮溶解，加入化合物2(7 mmol)，滴加1 mL三乙胺，反應(yīng)2 h，反應(yīng)完全后減壓蒸干丙酮，硅膠柱分離純化得到5a，洗脫劑為二氯甲烷。如圖4所示。

化合物5b與化合物5a合成方法類似。合成的化合物由核磁共振氫譜和質(zhì)譜來(lái)確認(rèn)?；衔?a(5 mmol)用15 mL丙酮溶解，加入白楊素(7 mmol)，滴加1 mL三乙胺，反應(yīng)2 h，反應(yīng)完全后減壓蒸干丙酮，硅膠柱分離純化6a，洗脫劑為二氯甲烷?；衔?b與化合物6a合成方法類似。合成的化合物由核磁共振氫譜和質(zhì)譜來(lái)確認(rèn)。

圖4 目標(biāo)化合物5a、5b、6a和6b的合成路線

1.3.4 抗腫瘤活性測(cè)定 采用MTT法研究化合物2，5a，5b，6a，6b，白楊素對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803、乳腺癌細(xì)胞MCF-7和肝癌細(xì)胞HepG-2的體外抗腫瘤活性，以5-氟尿嘧啶作為陽(yáng)性對(duì)照。胃癌細(xì)胞MGC-803培養(yǎng)在含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基中，乳腺癌細(xì)胞MCF-7和肝癌細(xì)胞HepG-2培養(yǎng)在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中。細(xì)胞均在37 ℃，5% CO2及90%濕度條件下培育。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞接種于96孔板，接種密度為8×103/孔，24 h后用不同濃度(256，128，64，32，16，8，4，2 μmol/L)的化合物進(jìn)行處理。48 h后，每孔加入20 μL的MTT溶液(5 mg/mL)。4 h后，每個(gè)孔加入150 μL的DMSO溶解晶體，并在490 nm處測(cè)量吸光度。50%細(xì)胞的抑制濃度(IC50)是由Logit法測(cè)定的。所有實(shí)驗(yàn)均操作3次。

2 結(jié) 果

2.1目標(biāo)化合物的表征5,6,7-三甲氧基-4′-羥基黃酮(2)：金黃色粉末，產(chǎn)率：36%，熔點(diǎn)：194-195 ℃。1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ 7.78(d, J=8.4 Hz, 2H), 6.88(d, J=8.5 Hz, 2H), 6.73(s, 1H), 6.53(s, 1H), 5.11(s, 1H), 4.24(s, 3H), 3.96(s, 3H), 3.81(s, 3H). MS(ESI): 329.1(C18H16O, [M+H+])。

(5,6,7-三甲氧基-4-氧代-4H-苯并吡喃-2-基)苯基5-氯-2-甲氧基苯甲酸甲酯(5a)：黃色粉末，產(chǎn)率：71%，熔點(diǎn)：133～135 ℃。1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ 7.93(s，1H)，7.83(t，J=12.9 Hz，2H)，7.43(t，J=10.5 Hz，1H)，7.20(d，J=7.3 Hz，2H)，6.92(d，J=8.9 Hz，1H)，6.72(d，J=20.0 Hz，1H)，6.49(s，1H)，4.31-4.09(m，3H)，3.87(t，J=19.9 Hz，6H)，3.72(d，J=27.4 Hz，3H). MS(ESI):498.1(C26H21O8Cl，[M+H+])。

(5,6,7-三甲氧基-4-氧代-4H-苯并吡喃-2-基)苯基4-氯-2-甲氧基苯甲酸甲酯(5b)：黃色粉末，產(chǎn)率：69%，熔點(diǎn)：144～151 ℃。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ 7.98(d，J=8.7 Hz，1H)，7.90(d，J=8.7 Hz，2H)，7.27(d，J=8.7 Hz，2H)，7.06-7.02(m，2H)，6.76(s，1H)，6.54(s，1H)，4.25(s，3H)，3.97(s，3H)，3.94(s，3H)，3.81(s，3H). MS(ESI): 498.1(C26H21O8Cl，[M+H+])。

5-羥基-4-氧代-2-苯基-4H-苯并吡喃-7-基5-氯-2-甲氧基苯甲酸甲酯(6a)：淺黃色粉末，產(chǎn)率：78%，熔點(diǎn)：198-198.5 ℃。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ 12.74(s，1H)，7.97(d，J=2.7 Hz，1H)，7.91-7.87(m，2H)，7.57-7.49(m，4H)，6.99(dd，J=5.5，3.5 Hz，2H)，6.74(s，1H)，6.69(d，J=2.0 Hz，1H)，3.94(s，3H). MS(ESI):507.4(C23H15O5Cl，[M+H+])。

5-羥基-4-氧代-2-苯基-4H-苯并吡喃-7-基4-氯-2-甲氧基苯甲酸酯(6b)：淺黃色粉末，產(chǎn)率：80%，熔點(diǎn)：194-195 ℃。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ 12.77(s，1H)，8.21(dd，J=7.9，1.6 Hz，1H)，7.89(dd，J=8.1，1.6 Hz，2H)，7.70-7.64(m，1H)，7.54(dd，J=6.9，4.6 Hz，2H)，7.41(td，J=7.8，1.1 Hz，1H)，7.20-7.17(m，1H)，6.93(d，J=2.1 Hz，1H)，6.74(s，1H)，6.66(d，J=2.1 Hz，1H)，2.32(s，3H). MS(ESI): 407.4(C23H15O5Cl，[M+H+])。

2.2抗腫瘤活性表1為化合物2、5a、5b、6a、6b和白楊素的抗腫瘤活性，以5-氟尿嘧啶為陽(yáng)性對(duì)照?；衔飳?duì)胃癌細(xì)胞MGC-803、乳腺癌細(xì)胞MCF-7和肝癌細(xì)胞HepG-2均有較好的抗腫瘤活性，其中對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803整體的抗腫瘤活性優(yōu)于其它兩種癌細(xì)胞。化合物2、5a、5b、6a、6b對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803的抗腫瘤活性優(yōu)于白楊素與陽(yáng)性對(duì)照藥5-氟尿嘧啶，其中5b的抗腫瘤活性為21.59±5.75 μmol/L。

表1 化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞體外抗活性的測(cè)定

3 討 論

癌癥目前已經(jīng)成為了一個(gè)全球性難以治療的疾病。常見(jiàn)的胃癌、乳腺癌和肝癌為我國(guó)排名前五的惡性腫瘤，由癌癥造成的死亡已連續(xù)多年占據(jù)我國(guó)居民死亡原因的首位。

近年來(lái)，黃酮類化合物及其衍生物的抗腫瘤活性研究引起了人們的廣泛關(guān)注，但由于其溶解性差，生物利用度低，無(wú)靶向作用等原因限制了其在臨床方面的應(yīng)用。因此，通過(guò)對(duì)黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)修飾和衍生化來(lái)解決上述問(wèn)題，對(duì)篩選出高效低毒的抗腫瘤靶向藥物具有重要意義。

以3,4,5-三甲氧基苯酚為原料，通過(guò)Friedel-Crafts反應(yīng)合成2′-羥基-4′,5′,6′-三甲氧基-2-氯苯乙酮(1)，然后通過(guò)改進(jìn)后的Baker-Venkataraman 重排反應(yīng)合成5,6,7-三甲氧基-4′-羥基黃酮(2)。水楊酸衍生物完成甲基化反應(yīng)和酰氯化反應(yīng)后，與化合物2和白楊素發(fā)生酯化反應(yīng)得到目標(biāo)化合物5a、5b、6a、6b。體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，具有苯三甲氧基基團(tuán)的化合物2及其衍生物5a、5b的抗腫瘤活性優(yōu)于白楊素及其衍生物6a、6b，說(shuō)明黃酮骨架引入苯三甲氧基基團(tuán)在一定程度上能增強(qiáng)其抗腫瘤活性。其中5b表現(xiàn)出較好的抗腫瘤活性，可進(jìn)一步研究其抗腫瘤活性與作用機(jī)制。

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