STGC3基因高表達(dá)對CNE2細(xì)胞放療敏感性的影響

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(南華大學(xué)腫瘤研究所，湖南 衡陽 421001)

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一種起源于鼻咽黏膜上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，其高發(fā)人群主要分布于我國南方、香港、東南亞等地區(qū)[1]。其組織學(xué)特性以及解剖部位特點決定了放射治療是鼻咽癌的首選治療方式。然而，放療所產(chǎn)生的副作用以及因放療抵抗而導(dǎo)致部分病人治療失敗的問題依然存在，因此，探尋提高放療敏感性的策略及分子機制將有助于提高鼻咽癌患者放射治療效果。

自噬是真核細(xì)胞中一種進化上高度保守的溶酶體依賴性降解途徑。在能量缺乏，缺氧等應(yīng)激壓力下，細(xì)胞可以通過自噬，將受損的蛋白質(zhì)及細(xì)胞器降解，最終產(chǎn)物可以釋放進入胞漿，重新供給細(xì)胞利用，從而維持細(xì)胞生存以及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。研究表明，放療可以誘導(dǎo)腫瘤自噬，且自噬水平增高是腫瘤細(xì)胞放療抵抗的機制之一[2-3]。

STGC3基因是本課題組成員所克隆的一個鼻咽癌相關(guān)候選抑癌基因[4]，前期研究表明，在鼻咽癌細(xì)胞和組織中，STGC3基因的表達(dá)下調(diào)或缺失?；謴?fù)STGC3基因在鼻咽癌CNE2細(xì)胞的表達(dá)，CNE2細(xì)胞生長增殖、體外成瘤能力均下降[5-6]。然而，其確切的功能及作用機制仍有待闡明，因此，本文擬通過構(gòu)建STGC3基因高表達(dá)的CNE2細(xì)胞系，初步探討STGC3基因高表達(dá)對CNE2細(xì)胞放療敏感性的影響及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1材料STGC3基因穩(wěn)定高表達(dá)CNE2細(xì)胞系(CNE2-RTP-hSTGC3-his)以及轉(zhuǎn)染空載體CNE2的細(xì)胞系(CNE2-RTP-his)已由本課題組成員前期構(gòu)建完成，并保存于本研究所-80 ℃超低溫冰箱。RPMI-1640購自Hyclone公司；小牛血清購自杭州四季青公司；LC3、SQSTM1/p62兔抗人單克隆抗體均購自CST公司；SFN鼠抗人單克隆抗體購自Abcam公司；SDS-PAGE凝膠試劑盒、RIPA裂解液(強)、蛋白質(zhì)上樣緩沖液、考馬斯亮藍(lán)常規(guī)染色試劑盒均購自北京康為世紀(jì)公司；CCK-8試劑購自Dojindo。

1.2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的鑒定與分組復(fù)蘇CNE2、CNE2-RTP-his、CNE2-RTP-hSTGC3-his三組細(xì)胞，分別設(shè)置為空白對照組、陰性對照組、實驗組。將各組細(xì)胞置于含10%小牛血清培養(yǎng)基中，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞生長密度達(dá)到80%時，置于熒光顯微鏡下拍照。Western blot檢測各組細(xì)胞中STGC3蛋白的表達(dá)。按常規(guī)方法，加入RIPA裂解液，充分裂解后，于4 ℃，12 000 rpm，離心15 min，收集上清液。將收集的樣品與蛋白上樣緩沖液以4∶1的比例，100 ℃煮沸5 min。煮沸后的樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。隨后加入兔抗人STGC3多克隆抗體，4 ℃孵育過夜。TBST液洗膜3次，10 min/次，加入羊抗兔熒光二抗，暗處室溫孵育2 h。再次用TBST液洗膜3次，10 min/次。近紅外雙熒光掃描儀顯影。

1.3細(xì)胞照射各組細(xì)胞生長密度約為80%時，X線照射細(xì)胞。每組細(xì)胞設(shè)置3個平行樣本。照射條件：室溫條件下，6 MV X線照射細(xì)胞，總劑量為4Gy(劑量率為200 cGy/min)，源皮距100 cm，照射野為20 cm×20 cm。培養(yǎng)瓶細(xì)胞貼壁面朝上，其上方墊1.5 cm組織等效補償膜；96孔板上方墊1 cm組織等效補償膜。

1.4 CCK-8測定細(xì)胞活力各組細(xì)胞以5×103個/孔的數(shù)量同時接種于96孔板，每組設(shè)置5個復(fù)孔。照射后4 h、24 h分別吸盡孔板內(nèi)的培養(yǎng)基，PBS清洗3遍，更換新鮮的含10%血清培養(yǎng)基，100 μL/孔，同時10 μL /孔加入CCK-8溶液。37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。測定450 nm處的OD值，評價細(xì)胞活力。

1.5質(zhì)譜分析照射前后蛋白表達(dá)差異各組細(xì)胞照射前和在照射后4 h分別提取總蛋白，與蛋白上樣緩沖液以4∶1的比例，100 ℃煮沸5 min。經(jīng)SDS-PAGE電泳后，將凝膠用考馬斯亮藍(lán)室溫染色2 h。隨后脫色液脫色6 h，期間更換3次脫色液。脫色完全后，選取表達(dá)存在差異的條帶，送至上海生工生物公司進行質(zhì)譜分析，并通過String蛋白質(zhì)相互作用預(yù)測系統(tǒng)(www.string-db.org， Version 10.5)對質(zhì)譜分析結(jié)果進行蛋白質(zhì)相互作用的預(yù)測及分析。

1.6 Western blot檢測照射后蛋白表達(dá)各組細(xì)胞照射后4 h提取總蛋白，Western blot檢測SFN蛋白、自噬相關(guān)蛋白LC3與SQSTM1/p62的表達(dá)。具體步驟同前。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)SPSS16.0處理，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間兩兩比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染STGC3高表達(dá)CNE2細(xì)胞系CNE2-RTP-hSTGC3-his的鑒定熒光顯微鏡下觀察紅色熒光蛋白(Red fluorescence protein,RFP)的表達(dá)情況，可見CNE2-RTP-his組和CNE2-RTP-hSTGC3-his組中有RFP的表達(dá)，且熒光細(xì)胞數(shù)>80%(圖1)。Western blot結(jié)果顯示，STGC3蛋白在實驗組中表達(dá)升高(圖2)。

2.2 CCK-8測定細(xì)胞活力結(jié)果X線照射后CCK-8法測定細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，與空白對照組和陰性對照組比較，照射后實驗組細(xì)胞活力明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

圖1 熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率(200×)

圖2 Western blot檢測各組細(xì)胞中STGC3蛋白表達(dá)A：CNE2 B：CNE2-RTP-his C：CNE2-RTP-hSTGC3-his.與CNE2-RTP-his組比較，*P<0.05；與CNE2組比較，#P<0.05

時間CNE2(空白對照組)CNE2-RTP-his(陰性對照組)CNE2-RTP-hSTGC3-his(實驗組)4h1.34±0.080.80±0.060.70±0.01a24h2.29±0.080.75±0.030.47±0.01a

與陰性對照組比較，aP<0.05

2.3蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析提取照射前、后各組細(xì)胞蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，將凝膠考馬斯亮藍(lán)染色。脫色后，凝膠成像系統(tǒng)拍照，并根據(jù)條帶顏色深淺，選取照射后表達(dá)存在差異的條帶進行基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜質(zhì)譜分析(Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, Maldi-TOF)(圖3)。若Mascot分?jǐn)?shù)>43分(P<0.05)，則認(rèn)為條帶得到鑒定。本實驗選取了3條X線照射后，顏色加深的條帶，分別記為①，②，③。鑒定結(jié)果顯示，①號蛋白條帶為SFN(Score=44)；②號蛋白條帶為TUBA1B(Score=78)；③號條帶為calnexin(Score=56)(圖4)，顯示這三種蛋白在X線照射后表達(dá)可能增加。運用String蛋白質(zhì)相互作用預(yù)測系統(tǒng)，顯示三種篩選蛋白可通過熱休克蛋白5(Heat shock protein 5, HSPA5)與自噬相關(guān)蛋白相互作用(圖5)，相互作用蛋白質(zhì)的信息及分值見表2。

圖3 凝膠考馬斯亮藍(lán)染色黑白成像1：CNE2 2：CNE2-RTP-his 3：CNE2-RTP-hSTGC3-his.△代表細(xì)胞已經(jīng)照射處理； ①、②、③為選取的表達(dá)差異條帶

圖4 Maldi-TOF-TOF質(zhì)譜分析①SFN；②TUBA1B；③calnexin

2.4照射后自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(Microtubule associated protein 1 light chain 3, LC3)和p62蛋白測定自噬發(fā)生時，定位于自噬體膜上的LC3-II的表達(dá)增加，而自噬特異性降解蛋白p62的表達(dá)則降低。因此，通過計算LC3-II/β-actin以及p62/β-actin的相對比值可以評價LC3-II以及p62的表達(dá)水平，同時也一定程度反映自噬的活性。Western blot結(jié)果顯示，實驗組中，LC3-II的表達(dá)水平較對照組降低(P<0.05)(圖6)，p62的表達(dá)水平相比對照組則升高(P<0.05)(圖7)。

圖5 蛋白質(zhì)相互作用預(yù)測網(wǎng)絡(luò)圖

Protein nameLC3A/BSFNTUBA1BSQSTM1CANXHSPA5LC3A/B0.5130.9780.458SFN0.5130.559TUBA1B0.5130.439SQSTM10.9780.579CANX0.996HSPA50.4580.5590.4390.5790.996

圖6 Western blot檢測LC3蛋白A：CNE2； B：CNE2-RTP-his； C：CNE2-RTP-hSTGC3-his. 與CNE2-RTP-his組比較，*P<0.05

圖7 Western blot檢測p62蛋白A：CNE2；B：CNE2-RTP-his；C：CNE2-RTP-hSTGC3-his. 與CNE2-RTP-his組比較，*P<0.05

2.5照射后SFN蛋白測定SFN蛋白可以通過多條途徑參與自噬的調(diào)節(jié)，結(jié)合質(zhì)譜分析結(jié)果與文獻參考，通過檢測SFN蛋白的表達(dá)水平，初步探討STGC3基因?qū)ψ允烧{(diào)控的可能機制。Western blot結(jié)果顯示，經(jīng)X線照射后，實驗組細(xì)胞中SFN蛋白的表達(dá)水平較對照組降低(P<0.05)(圖8)。

圖8 Western blot檢測SFN蛋白A：CNE2 B：CNE2-RTP-his C：CNE2-RTP-hSTGC3-his. 與CNE2-RTP-his組比較，*p<0.05

3 討 論

放射抗拒是臨床上鼻咽癌治療的一大障礙，尋找提高放療敏感性的潛在機制有助于針對性地設(shè)計治療方案，從而提高腫瘤放射治療的效果。STGC3基因是本課題組所克隆的鼻咽癌相關(guān)候選抑癌基因(GeneBank登錄號為AY078383)，該基因定位于3p21，開放閱讀框為438 bp,編碼一個由146個氨基酸組成，分子量為16 kD的蛋白質(zhì),定位于胞核與胞漿[4]。前期研究已經(jīng)表明，STGC3基因具有抑制鼻咽癌細(xì)胞惡性表型的作用，但STGC3基因?qū)Ρ茄拾┓暖煹挠绊懠翱赡艿臋C制尚不明確。

本實驗顯示，在經(jīng)過X線照射處理后，STGC3基因高表達(dá)可以降低鼻咽癌CNE2細(xì)胞的活力，初步證明STGC3基因高表達(dá)可以提高CNE2細(xì)胞對放療的敏感性。作為一種維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要機制，自噬廣泛參與多種細(xì)胞功能，既能在代謝應(yīng)激壓力時保護細(xì)胞，又能因為過度活化而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生II型程序性死亡[7]。有研究表明，腫瘤細(xì)胞可以通過放療誘導(dǎo)的自噬清除胞內(nèi)受損的DNA、細(xì)胞器和蛋白質(zhì)等，緩解應(yīng)激壓力并促進腫瘤細(xì)胞生存[8]。然而，但在不同類型的組織或腫瘤中，自噬所起作用并不相同。一方面，抑制自噬可以提高腫瘤細(xì)胞的放療敏感性[9]；另一方面，也有研究報道誘導(dǎo)自噬可以降低腫瘤細(xì)胞的放療抵抗[10]。因此調(diào)節(jié)自噬在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，有望為提高放療效果提供一個新的途徑。當(dāng)自噬發(fā)生時，分布于胞漿的LC3-I與磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)結(jié)合，轉(zhuǎn)換形成LC3-II并定位于自噬體膜，因此LC3-II蛋白被用作檢測自噬體的標(biāo)志，其表達(dá)水平在某種程度上反應(yīng)自噬的活性[11]。然而，僅僅檢測自噬體數(shù)量不足以全面評估自噬活性，應(yīng)同時結(jié)合自噬性降解底物的檢測進行綜合觀察。p62是一種自噬特異性降解蛋白，自噬發(fā)生時，p62連同受損的細(xì)胞器在自噬溶酶體被降解，導(dǎo)致其表達(dá)水平降低。而當(dāng)自噬發(fā)生受阻時，p62則會大量堆積[12]。因此，通過計算LC3-II/β-actin以及p62/β-actin的相對比值可以評價LC3-II和p62的表達(dá)水平，同時也一定程度反映自噬的活性。本實驗顯示，與對照組相比較，實驗組中的LC3-II表達(dá)降低，而p62的表達(dá)水平升高，因此推測STGC3基因可以通過抑制自噬提高CNE2細(xì)胞對放療的敏感性。

為了進一步探究STGC3基因調(diào)節(jié)自噬的可能機制，本實驗通過蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析照射前、后表達(dá)存在差異的蛋白，初步篩選出TUBA1B、calnexin、SFN三種差異蛋白。微管蛋白(TUBA1B)是構(gòu)成細(xì)胞骨架的主要成分之一，參與多種細(xì)胞活動，如構(gòu)成細(xì)胞支架，參與物質(zhì)運輸和轉(zhuǎn)運，形成紡錘體調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂等。研究顯示，腫瘤中存在著某些微管相關(guān)蛋白的異常表達(dá)，這些蛋白可以引起微管動態(tài)系統(tǒng)的失衡，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[13]。鈣聯(lián)蛋白(calnexin)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的一種跨膜蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)的代謝、應(yīng)激反應(yīng)、凋亡[14]，干擾鈣聯(lián)蛋白的表達(dá)可以提高結(jié)腸癌細(xì)胞對5-氟尿嘧啶的敏感性，降低結(jié)腸癌細(xì)胞的生存率[15]。然而，目前關(guān)于微管蛋白和鈣聯(lián)蛋白在自噬調(diào)控中的研究甚少，未見相關(guān)報道表明兩者參與調(diào)節(jié)自噬。SFN蛋白具有調(diào)控細(xì)胞周期、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖分化等多種功能，可以通過MAPK、PI3K、mTOR等多個途徑參與自噬調(diào)節(jié)。研究表明，SFN可與hVps34、TSC2、 PRAS40等蛋白結(jié)合[16-18]，通過mTORC1途徑調(diào)節(jié)自噬起始進而影響細(xì)胞自噬。除此之外，也有研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)SFN可以抑制Beclin 1的表達(dá)并減少GFP-LC3的點狀聚集[19]。有此可見，SFN蛋白在自噬的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組中SFN蛋白的表達(dá)下降。因此推測，STGC3基因可能通過抑制SFN表達(dá)而抑制放療引起的CNE2細(xì)胞自噬，但其確切的機制仍需在未來的研究中進一步探明。

綜上所述，本實驗結(jié)果初步表明，STGC3基因高表達(dá)可能通過抑制SFN的表達(dá)而抑制放療引起的自噬，進而提高鼻咽癌CNE2細(xì)胞的放療敏感性。

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