改良堿裂解法和煮沸法提取金黃色葡萄球菌DNA效果的比較

鄒治情， 王俊玲， 陳思， 謝雨， Dinsh Kumar K,吳亮，*， 姜旭淦， 陰晴， 陳盛霞， 許化溪

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

金黃色葡萄球菌是臨床常見的革蘭陽性菌，可產(chǎn)生多種毒力因子，引起感染者食物中毒、假膜性腸炎、燙傷樣皮膚綜合征、毒素休克綜合征、化膿性炎癥和敗血癥等，給患者造成極大損害[1]。近年來隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，金黃色葡萄球菌耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重，臨床耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)分離率逐年提升。目前金黃色葡萄球菌的分離鑒定和耐藥性分析需要5～7 d，方法煩瑣且耗時耗力，不能滿足臨床診斷需求。PCR法等分子生物學(xué)技術(shù)是目前公認最具發(fā)展前景的細菌鑒定和耐藥性分析技術(shù)，具有高靈敏度、高特異性及操作簡便迅速等優(yōu)點[2]。但PCR法檢測結(jié)果的靈敏度和可信度依賴模板DNA質(zhì)量，因此獲得高質(zhì)量的金黃色葡萄球菌基因組DNA對于開展PCR檢測工作十分重要[3]。

金黃色葡萄球菌具有厚重的細胞壁，煮沸、凍融和溶菌酶裂解等常規(guī)方法難以有效破壞其細胞壁[4]。此外大部分臨床菌株還能分泌耐熱核酸酶，經(jīng)煮沸后耐熱核酸酶仍具有降解細菌核酸的能力[5]。因此金黃色葡萄球菌基因組DNA提取難度較大，使用常規(guī)方法提取細菌基因組DNA產(chǎn)率極低，無法用于PCR擴增。本研究中我們參考植物細胞基因組DNA堿裂解提取法并加以改進，建立了一種簡單、經(jīng)濟、有效的提取方法，現(xiàn)報告如下。

1 材料和方法

1.1 菌種

10株金黃色葡萄球菌株由江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科微生物室鑒定分離，均經(jīng)VITEKⅡCompact全自動細菌鑒定儀(法國生物梅里埃公司)鑒定為MRSA菌。所有細菌均先涂布于血瓊脂培養(yǎng)基活化，再挑取單個菌落接種于水解酪蛋白培養(yǎng)基(Mueller-Hinton, MH)，經(jīng)37℃連續(xù)振搖培養(yǎng)16 h后獲得新鮮菌液。細菌菌落和新鮮菌液用于后續(xù)細菌基因組DNA提取。

1.2 主要試劑

血瓊脂培養(yǎng)平板和MH培養(yǎng)基(法國生物梅里埃公司)；酵母浸出液和胰蛋白胨(英國OXIOD公司)；溶菌酶(美國Amersco公司)；20 mg/mL蛋白酶K溶液(美國Merck公司)。2×PCR預(yù)混液(Dye Plus)購自南京Vazyme公司；瓊脂糖為西班牙進口分裝；TanonTMDNA 標(biāo)準(zhǔn)參照物購自上海天能公司。改良堿裂解法提取試劑包括3種：溶液1中含有25 mol/L Tris·HCl，10 mmol/L EDTA-Na2和50 mmol/L葡萄糖；溶液2中含有0.2 mol/L NaOH和10%(w/v)SDS，該液現(xiàn)配現(xiàn)用；溶液3中含有醋酸鉀150 mg，冰醋酸11.5 mL，加滅菌雙蒸水至100 mL，室溫下保存?zhèn)溆谩Ｆ渌噭┚鶠閲a(chǎn)分析純。

1.3 引物

根據(jù)李克誠等[6]報道合成spa基因擴增引物，spa-F: 5′-TAAAGACGATCCTTCGGTGAGC-3′，spa-R：5′-CAGCAGTAGTGCCGTTTGCTT-3′，預(yù)測產(chǎn)物長度為n×170 bp。根據(jù)黃輝等[7]報道合成mecA基因和femB基因擴增引物，mecA-F:5′-GGCATTCGTGTCACAATCG-3′，mecA-R:5′-CTGGAACTTGTTGAGGAGAG-3′, 預(yù)測產(chǎn)物長度為310 bp；femB-F:5′-TTACAGAGTTAACTGTTACC-3′，femB-R: 5′-ATACAAATCCAGCACGCTCT-3′，預(yù)測產(chǎn)物長度為651 bp。上述引物由蘇州漲迅生物公司合成。

1.4 細菌基因組DNA提取方法

1.4.1 直接煮沸法 在1.5 mL滅菌Ep管中加入200 μL滅菌雙蒸水，從血瓊脂平板上挑取1個菌落與滅菌雙蒸水充分混合。將上述Ep管煮沸10 min后，經(jīng)14 000 r/min離心10 min，吸取上清液作為PCR反應(yīng)模板。

1.4.2 改良堿裂解法 按“1.1”方法擴增細菌，吸取200 μL新鮮菌液經(jīng)離心收集菌體沉淀，在上述菌體沉淀中加入180 μL溶液1并充分重懸，再加入20 μL溶菌酶溶液(20 mg/mL)，37℃孵育6 h消化細菌的細胞壁。在上述溶液中再加入20 μL蛋白酶K溶液(20 mg/mL)，60 ℃水浴1 h。加入新鮮配制的300 μL溶液2，室溫中反復(fù)上下顛倒10次并靜置10 min以充分裂解細菌。最后加入300 μL溶液3，上下顛倒5次充分混勻后于冰上放置5 min，以12 000 r/min離心5 min，取上清液600 μL，加入異丙醇500 μL，室溫中上下顛倒5次后靜置沉淀基因組DNA，10 min后以12 000 r/min離心5 min，棄去上清液。在沉淀中加入1 mL 70%乙醇，上下顛倒2次后于12 000 r/min離心2 min并棄去上清液。打開離心管蓋在室溫下放置10 min除去殘留乙醇，加入200 μL滅菌蒸餾水重新溶解金黃色葡萄球菌基因組DNA，用于后續(xù)PCR檢測。

1.5 PCR檢測

在PCR管中依次加入12.5 μL 2×PCR預(yù)混液(Dye Plus)，各引物0.3 μL，煮沸法制備模板和改良堿裂解法制備模板均為1 μL，以滅菌蒸餾水補足體系至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性 45 s,spa基因擴增時以55℃退火60 s,mecA基因擴增時以50.6 ℃退火45 s，femB基因擴增時以57 ℃退火45 s，所有PCR擴增均以72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并照相記錄。

2 結(jié)果

2.1 spa基因擴增結(jié)果

以改良堿裂解法制備的金黃色葡萄球菌DNA為模板，所有樣本可擴增出spa基因；以直接煮沸法制備的DNA為模板，僅3號樣本擴增出spa基因。見圖1。

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物；1-10：10株金黃色葡萄球菌菌株

2.2 mecA基因擴增結(jié)果

以改良堿裂解法制備的細菌DNA為模板，所有樣本可擴增出mecA基因；以直接煮沸法制備的DNA為模板，可見8號和9號樣本擴增出明亮的mecA基因，3號和7號樣本可見隱約的mecA基因。見圖2。

2.3 femB基因擴增結(jié)果

以改良堿裂解法制備的金黃色葡萄球菌DNA為模板，可擴增出3號、4號、6號和9號樣本的femB基因；以直接煮沸法制備的DNA為模板，無樣本擴增出femB基因。見圖3。

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物；1-10：10株金黃色葡萄球菌菌株

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物；1-10：10株金黃色葡萄球菌菌株

3 討論

常規(guī)方法難以有效破壞金黃色葡萄球菌堅固的細胞壁，使得基因組DNA提取效率極低，無法用于PCR法檢測[8]。雖然目前已有多種金黃色葡萄球菌基因組DNA提取方法，包括SDS裂解法、CTAB法、反復(fù)凍融裂解法等，但都存在操作復(fù)雜、耗時長、提取效率低等缺點[9]。現(xiàn)有的DNA抽提試劑盒雖然可以有效提取金黃色葡萄球菌基因組DNA，但使用成本高，增加了患者的經(jīng)濟負擔(dān)，也阻礙了分子生物學(xué)技術(shù)在金黃色葡萄球菌研究中的推廣使用[3]。

與金黃色葡萄球菌相似，植物細胞也具有堅固的細胞壁。常規(guī)PCR檢測多采用堿裂解法破壞細胞壁提取植物細胞基因組DNA，而無需使用液氮研磨等方式[10]。本研究中我們借鑒植物細胞基因DNA的堿裂解提取法并降低了提取試劑中NaOH濃度，建立了改良堿裂解法提取金黃色葡萄球菌基因組DNA技術(shù)。該方法不僅可以有效裂解金黃色葡萄球菌細胞壁，同時可以抑制細菌釋放的核酸酶活性，具有較高的DNA提取效率，并能夠縮短操作時間，完全可以滿足臨床檢驗科開展后續(xù)分子生物學(xué)檢測的要求，值得推廣使用。

煮沸法是目前最常用的細菌基因組DNA抽提方法，該方法無需其他試劑，方便快捷，廣泛用于各種細菌PCR檢測前的模板制備[11]。本研究中我們采用PCR法檢測了MRSA菌中spa基因、mecA基因和femB基因。我們的研究結(jié)果表明，與改良堿裂解法相比，直接煮沸法制備模板擴增出來的spa基因、mecA基因和femB基因的標(biāo)本數(shù)量明顯低于改良堿裂解法。我們推測，由于金黃色葡萄球菌細胞壁較厚，單純地煮沸并不能有效裂解細菌。同時臨床分離獲得的金黃色葡萄球菌多為致病菌，自身還分泌耐熱核酸酶，該酶在煮沸后并不會失活，仍可以降解細菌裂解所釋放出的核酸，因此煮沸法所獲得的模板DNA量較少，導(dǎo)致PCR法無法檢測出細菌相關(guān)基因[12]。改良堿裂解法中，我們借鑒大腸埃希菌質(zhì)粒抽提方法，在DNA抽提體系中加入SDS和NaOH，這兩種試劑不僅可以裂解細菌，還將整個體系pH值調(diào)整至8.0以上，可有效地抑制核酸酶活性，防止細菌DNA被降解。

由于單純煮沸無法裂解金黃色葡萄球菌，普通溶菌酶裂解效果也較差，許多學(xué)者使用特殊的葡萄球菌酶裂解金黃色葡萄球菌，但該酶成本高昂[13]。本研究中，我們通過摸索發(fā)現(xiàn)，普通溶菌酶只需將37℃孵育時間延長至6 h，再配合使用堿裂解法即可獲得理想的裂解效果。該方法雖然延長了抽提基因組DNA的時間，但避免使用較為昂貴的葡萄球菌酶，節(jié)省了成本，建議推廣使用。

[ 1 ] 王鳳玲, 侯英榮，馮秀河. 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因及致病毒素基因的研究進展[J]. 中國感染與化療雜志, 2010, 10(1):72-75.

[ 2 ] Mehta MS, McClure JT, Mangold K, et al. Performance of 3 real-time PCR assays for direct detection ofStaphylococcusaureusand MRSA from clinical samples[J]. Diagn Microbiol Infect Dis, 2015, 83(3):211-215.

[ 3 ] Sabat A, Malachowa N, Miedzobrodzki J, et al. Comparison of PCR-based methods for typingStaphylococcusaureusisolates[J]. J Clin Microbiol, 2006, 44(10):3804-3807.

[ 4 ] 張濤濤, 王蘭,龔頻，等. 金黃色葡萄球菌基因組DNA提取方法的優(yōu)化[J]. 食品研究與開發(fā), 2014, 35(3):8-10.

[ 5 ] 馮飛, 梁景龍，蘇麗婷，等. 不同方法對金黃色葡萄球菌基因組DNA提取效果的比較[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 37(10):153-155.

[ 6 ] 李克誠, 李瓊, 夏菲，等. 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌spa基因分型[J].疾病監(jiān)測,2012,27(11):877-880.

[ 7 ] 黃輝, 陳穎, 安如俊，等. MRSA中mecA及femB基因的檢測與耐藥相關(guān)性[J]. 重慶醫(yī)學(xué), 2009,3(1):54-56.

[ 8 ] Huletsky A,Giroux R, Rossbach V,et al.New real-time PCR assay for rapid detection of methicillin-resistantStaphylococcusaureusdirectly from specimens containing a mixture of staphylococci[J]. J Clin Microbiol, 2004, 42(5):1875-1884.

[ 9 ] Maes N, Magdalena J, Rottiers S, et al. Evaluation of a triplex PCR assay to discriminateStaphylococcusaureusfrom coagulase-negative Staphylococci and determine methicillin resistance from blood cultures[J]. J Clin Microbiol, 2002, 40(4):1514-1517.

[10] Lartigue C, Glass JI, Alperovich N, et al. Genome transplantation in bacteria: changing one species to another[J]. Science, 2007, 317(5838):632-638.

[11] 李筱婷, 陳卓君, 許文濤, 等. 一種適于PCR擴增的植物基因組快速提取新方法[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報, 2010, 18(2): 394-399.

[12] Pilsczek FH, Salina D, Poon KK, et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response toStaphylococcusaureus[J].J Immunol,2010,185(12):7413-7425.

[13] Francius G, Domenech O, Mingeot-Leclercq MP, et al. Direct observation ofStaphylococcusaureuscell wall digestion by lysostaphin[J]. J Bacteriol, 2008, 190(24):7904-7909.