脂多糖對甲狀腺上皮細(xì)胞增殖、吞噬及胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生的影響

羅旋， 牟笑， 鄭婷婷， 董昕， 劉寶翠， 毛朝明

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

橋本甲狀腺炎是一種常見的器官特異性自身免疫性疾病，主要特點是甲狀腺特異性T淋巴細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞大量浸潤甲狀腺組織，以及甲狀腺上皮細(xì)胞(thyroid follicular cells, TFCs)的破壞，最終導(dǎo)致甲狀腺功能減退[1]。近年來研究表明，該病的發(fā)生與遺傳、吸煙、過量碘的攝入及感染等有密切的關(guān)系[2-6]。

脂多糖是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要致病成分，可以誘發(fā)多種炎性反應(yīng)。已有實驗證明脂多糖可以破壞T、B淋巴細(xì)胞對鼠甲狀腺免疫蛋白的耐受進(jìn)而促進(jìn)橋本甲狀腺炎的發(fā)生[7-8]，但是確切的機制尚不清楚。本研究分析脂多糖對TFCs的增殖、凋亡、吞噬及胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生的影響，探討脂多糖在橋本甲狀腺炎發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

TFCs系Nthy-ori 3-1細(xì)胞購于ECACC細(xì)胞中心。胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司)。脂多糖(Sigma公司),熒光微球(nile red fluorescent FluoSpheres? beads)為BD公司產(chǎn)品，MTT(上海碧云天生物公司)，AnnexinV Alexa Fluor 647/PI凋亡檢測試劑盒(南京福麥斯生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Nthy-ori 3-1細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(含100 μg·L-1鏈霉素、100 IU·L-1青霉素)，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法檢測Nthy-ori 3-1細(xì)胞增殖活性 將處于對數(shù)生長期的Nthy-ori 3-1細(xì)胞以每孔3.5×103個接種于96孔板中，每組設(shè)5個復(fù)孔，每孔加入200 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(含100 μg·L-1鏈霉素、100 IU·mL-1青霉素)，置于5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。第2天，濃度梯度組分別加入0、10、20、100、150 ng·mL-1的脂多糖處理Nthy-ori 3-1細(xì)胞48 h；時間梯度組加入100 ng·mL-1的脂多糖分別處理Nthy-ori 3-1細(xì)胞24 h和48 h。處理結(jié)束后，棄去上清液，每孔加入終濃度為0.5 mg·L-1的MTT培養(yǎng)基100 μL，置于5% CO2培養(yǎng)箱孵育4 h。棄去上清液，每孔加入100 μL DMSO振蕩5～10 min，使結(jié)晶充分溶解。用酶聯(lián)免疫分析儀(EXL800)測定490 nm波長各孔光密度(D)值。每組實驗重復(fù)3次，計算細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率(%)=D實驗組/D對照組×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測Nthy-ori 3-1細(xì)胞的凋亡 根據(jù)細(xì)胞增殖的實驗結(jié)果，選擇100 ng·mL-1的脂多糖處理Nthy-ori 3-1細(xì)胞48 h，無EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，250×g，離心5 min。用100 μL緩存液懸浮細(xì)胞，加入5 μL AnnexinV Alexa Fluor 647和10 μL 20 μg·mL-1的PI溶液，混勻室溫避光孵育15 min。孵育結(jié)束后，加400 μL PBS混勻，流式細(xì)胞儀檢測分析。

1.2.4 熒光微球攝入實驗評估Nthy-ori 3-1細(xì)胞的吞噬功能 實驗前1天將Nthy-ori 3-1細(xì)胞以5×105個/孔接種于6孔板中，每孔加入2 mL含0.5%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(含100 μg·L-1鏈霉素、100 IU·mL-1青霉素)，再分別加入0、10、20、100 ng·mL-1脂多糖，隨后將6孔板置于5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后，每孔加入熒光微球4 μL(終濃度為7.2×105個/mL)，置于5% CO2培養(yǎng)箱孵育4 h后，PBS洗3遍，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測熒光強度。

1.2.5 熒光探針DCFH-DA法檢測Nthy-ori 3-1胞內(nèi)活性氧的水平 將Nthy-ori 3-1細(xì)胞以5×105個/孔接種于6孔板中，每孔加入2 mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(含100 μg·L-1鏈霉素、100 IU·mL-1青霉素)，將6孔板置于5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。第2天，分別加入0、10、20、100 ng·mL-1脂多糖，4 h后每孔加入終濃度為10 μmol·L-1的DCFH-DA無血清RPMI-1640培養(yǎng)基1 mL，37 ℃培養(yǎng)箱孵育20 min。用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次。收集細(xì)胞，立即用流式細(xì)胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 脂多糖促進(jìn)Nthy-ori 3-1細(xì)胞的增殖

用0、10、20、100、150 ng·mL-1脂多糖分別作用Nthy-ori 3-1細(xì)胞48 h后，MTT檢測結(jié)果顯示，與0 ng·mL-1脂多糖對照組比較，各處理組Nthy-ori 3-1細(xì)胞的增殖率明顯增加(F=11.43，P<0.01；圖1A)，在100 ng·mL-1脂多糖作用時增殖明顯(t=5.115,P<0.01)，且在0～100 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。用100 ng·mL-1脂多糖分別作用Nthy-ori 3-1細(xì)胞24 h和48 h后，與對照組相比，細(xì)胞增殖明顯(F=16.25，P<0.01；圖1B)，其中以48 h時尤甚(t=7.01，P<0.01)。

2.2 脂多糖對Nthy-ori 3-1細(xì)胞凋亡無明顯影響

用100 ng·mL-1脂多糖作用Nthy-ori 3-1細(xì)胞48 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與0 ng·mL-1脂多糖對照組比較，100 ng·mL-1脂多糖處理組細(xì)胞凋亡率降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.697，P>0.05；圖2)。

A：脂多糖作用細(xì)胞48 h；B：100 ng/mL脂多糖處理細(xì)胞24 h和48 h；a：P<0.01，與0 ng/mL組比較；b：P<0.05，c：P<0.01，與0 h組比較

圖1MTT法檢測脂多糖處理后Nthy-ori3-1細(xì)胞的增殖率

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測脂多糖對Nthy-ori 3-1細(xì)胞凋亡的影響

2.3 脂多糖促進(jìn)Nthy-ori 3-1細(xì)胞的吞噬功能

熒光微球攝入實驗結(jié)果表明，用0、10、20、100 ng·mL-1脂多糖分別作用12 h后，Nthy-ori 3-1細(xì)胞的吞噬率明顯高于0 ng·mL-1脂多糖對照組(F=10.21，P<0.01；圖3)，在脂多糖20 ng·mL-1時達(dá)到最高峰(t=29.44，P<0.01)，提示脂多糖能促進(jìn)Nthy-ori 3-1細(xì)胞的吞噬且呈一定的劑量依賴性。

a：P<0.01，b：P<0.05，與0 ng·mL-1脂多糖比較

2.4 脂多糖促進(jìn)Nthy-ori 3-1細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生

用活性氧檢測探針DCFH-DA的平均熒光強度(MFI)反映Nthy-ori 3-1胞內(nèi)活性氧的水平。結(jié)果如圖4所示，10、20、100 ng·mL-1脂多糖作用4 h后，Nthy-ori 3-1細(xì)胞胞內(nèi)活性氧水平明顯高于0 ng·mL-1脂多糖對照組(F=21.67,P<0.01)，其中以100 ng·mL-1脂多糖時最為明顯(t=10.65，P<0.01)，顯示胞內(nèi)活性氧水平明顯上升。

a：P<0.01，與0 ng·mL-1脂多糖比較

3 討論

橋本甲狀腺炎是一種多因素誘導(dǎo)的自身免疫紊亂性疾病，機體針對自身抗原發(fā)生免疫應(yīng)答，大量的淋巴細(xì)胞浸潤甲狀腺組織，導(dǎo)致甲狀腺功能受損，甲狀腺腫大、纖維化最終導(dǎo)致甲狀腺功能減退[9-10]。TFCs是構(gòu)成甲狀腺組織的主要細(xì)胞，感染和過量碘的攝入可以誘導(dǎo)TFCs表達(dá)MHCⅡ，使其變成抗原提呈細(xì)胞，促進(jìn)橋本甲狀腺炎的發(fā)生發(fā)展[11-12]。研究表明脂多糖可以促進(jìn)na?ve CD4+T細(xì)胞向針對甲狀腺抗原的特異性Th17細(xì)胞分化，導(dǎo)致TFCs的免疫損傷，從而參與橋本甲狀腺炎的發(fā)病過程[13-14]。本研究通過體外實驗研究脂多糖對TFCs的增殖、吞噬和胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生能力的影響，探討脂多糖在橋本甲狀腺炎發(fā)病過程中的作用。

細(xì)胞增殖在一定程度上是細(xì)胞分化為多種功能表型的前提和基礎(chǔ)。在橋本甲狀腺炎的發(fā)病過程中，TFCs增殖能力的變化與發(fā)病密切相關(guān)。我們的實驗證明在100 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)脂多糖能夠促進(jìn)TFCs的增殖，對TFCs的凋亡無顯著影響。這與脂多糖對免疫細(xì)胞等的促凋亡作用是不一致的。已有報道[15]，脂多糖可以活化肝癌細(xì)胞表面的TLR4受體信號通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生存和增殖。出現(xiàn)兩種相反結(jié)論的原因可能與不同的細(xì)胞類型和不同的脂多糖作用濃度等因素相關(guān)。

高等動物的吞噬細(xì)胞通過吞噬作用，攝取和消滅感染的細(xì)菌,病毒以及損傷、衰老的細(xì)胞，是機體免受外來感染的第一道防線[16-17]。脂多糖可以增強單核-巨噬細(xì)胞的吞噬能力[18-19]，然而脂多糖對正常上皮細(xì)胞的吞噬功能的影響卻少有研究。本研究用熒光微球攝入法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)評價脂多糖對TFCs吞噬功能的影響，結(jié)果表明脂多糖能夠增強TFCs的吞噬功能，提示在炎癥介質(zhì)介導(dǎo)下TFCs參與了炎癥局灶部位的炎癥反應(yīng)。然而脂多糖促進(jìn)TFCs吞噬功能的機制尚需進(jìn)一步探討。

活性氧是超氧陰離子、過氧化氫、羥自由基、一氧化氮等一類具有很高生物活性的含氧化合物的總稱，參與細(xì)胞的增殖、凋亡、免疫及抗微生物等過程[20-21]。大量研究表明脂多糖能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞及上皮細(xì)胞產(chǎn)生大量的活性氧等炎性介質(zhì)，進(jìn)而加重局部炎性反應(yīng)[22]。我們的研究結(jié)果顯示，100 ng/mL脂多糖作用4 h能明顯提高TFCs胞內(nèi)活性氧的水平，從而加劇細(xì)胞的自身損傷，有助于橋本甲狀腺炎的炎癥反應(yīng)和疾病發(fā)展。

綜上所述，脂多糖通過促進(jìn)TFCs增殖、上調(diào)TFCs的吞噬活性和提高胞內(nèi)活性氧水平從而促進(jìn)橋本甲狀腺炎的炎癥反應(yīng)過程，顯示了脂多糖在橋本甲狀腺炎發(fā)生、發(fā)展中的重要致病作用。

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